重型颅脑损伤患者血浆外泌体微小RNA-202-5p表达水平及其对预后的预测价值

张颖洁, 王诗波, 诸 靖, 王 静, 虞大为

(中国人民解放军联勤保障部队第九〇四医院 急诊科, 江苏 无锡, 241000)

重型颅脑损伤是一种非常严重的颅脑创伤，其特点是致残率、病死率高[1]。格拉斯哥昏迷量表(GCS)评分和鹿特丹计算机断层扫描(CT)常被用作预测预后的指标[2-3]。但研究发现，这些指标准确率差，容易受到多种因素的干扰，因此寻找更佳灵敏的指标用于早期评估创伤严重程度和预测重型颅脑损伤(sTBI)的预后成为研究热点。sTBI患者神经功能缺损主要涉及到神经元细胞凋亡、炎症反应及自噬等复杂机制。微小RNA(miRNA) 参与多种生物学行为，研究[4-5]发现, miRNA与脑损伤的发生和进展密切有关。miR-202-5p具有抗肿瘤、调控细胞凋亡和自噬及保护脑神经元细胞缺血再灌注损伤等功能[6-8]。本研究分析了sTBI患者血浆外泌体miR-202-5p的水平，并探讨其对sTBI预后的预测能力，以期为sTBI的防治提供新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年1月—2020年12月收治的sTBI患者78例为研究对象，其中男43例，女35例; 年龄18～53岁，平均(42.4±5.3)岁。纳入标准: ① 经临床、影像学检查符合sTBI诊断标准[9]者; ② 外伤病史明确者; ③ 入院GCS评分为3～8分者; ④ 年龄≥18周岁者; ⑤ 临床资料无缺失者。排除标准: ① 既往有脑血管意外疾病、颅脑外伤者; ② 严重的心、肝、肾功能不全者; ③ 合并恶性肿瘤者; ④ 受伤到住院时间长于12 h者; ④ 有先天性疾病导致神经功能障碍者。另外选取同期体检中心健康人群50例为对照组，其中男29例，女21例; 年龄20～52岁，平均(41.7±4.8)岁。2组研究对象一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究患者家属签订书面知情同意书，并获得医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集: 入院后收集患者各项指标，包括年龄、性别、是否有吸烟或饮酒史、高血压、糖尿病、高脂血症等，记录从受伤到入院的时间，测量入院时血压，记录入院时GCS评分[10]和鹿特丹CT评分[11], 计算入院时急性生理学和慢性健康状况评价Ⅱ(APACHE Ⅱ)评分。

1.2.2 预后判断: 根据入院后3个月时格拉斯哥预后量表(GOS)评分将患者分为预后良好和预后不良。GOS评分≤3分定义为预后不良, >3分定义为预后良好。GOS评分中, 1分为死亡, 5分为神经功能基本正常[10]。

1.2.3 血清外泌体的分离及鉴定: 患者住院当日，健康人群于体检当日抽取肘静脉血5 mL, 150×g常温下离心15 min, 保留上清血浆。使用exoEasy Maxi kit试剂盒(Qiagen公司)提取外泌体，取10 μL滴于铜网上，滴加10 μL浓度为2%的醋酸双氧铀于铜网上静置1 min, 室温下放置10 min, 在透射电子显微镜下观察外泌体形态。采用Nano Sight纳米粒度仪检测外泌体颗粒浓度。

1.2.4 CD63蛋白量表达水平检测: 采用蛋白质印迹法检测CD63蛋白量表达水平。向提取的外泌体中加入1 mL RIPA液及PMFP液，冰上孵育30 min, 4 ℃ 14.0×g离心5 min, 保留上清液, 100 ℃下煮沸10 min, 检测蛋白浓度,15孔梳子中各孔加入20 μg蛋白，电泳1 h, 转膜45 min, 配好的封闭液封闭1 h, 兔抗人单克隆CD63(1∶1 000, Affinity Biosciences, 美国)4 ℃过夜，洗涤缓冲液(TBST)洗涤3 次，相应的二抗室温1 h, TBST洗涤3 次。然后上机曝光，采用Image J分析灰度值。

1.2.5 外泌体miR-202-5p表达水平检测: 采用实时荧光定量聚合酶链反应检测外泌体miR-202-5p表达水平。取外泌体200 μL, 加入1 mL Trizol, 利用一步法提取总RNA, 检测其浓度，合成cDNA, 按照荧光定量试剂盒说明进行聚合酶链反应，反应条件: 95℃预变性10 min, 95 ℃ 10 s、60 ℃ 1 min, 共40个循环，相对表达量用2-△△Ct法计算。引物序列如下, miR-202-5p正向序列: 5′-TTCCTATGCATATACTTC-3′; 反向序列: 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′ ,U6正向序列: 5′-ACACTCCAGCTGGGGTGCTCGCTTCGGCAGCACA-3′; 反向序列: 5′-AGGGTCCGAGGTATTC-3′。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 血清外泌体的形态特征

纳米颗粒跟踪(NTA)分析显示，外泌体直径为80～300 nm, 分散均匀，峰值为130 nm左右。透射电子显微镜显示，外泌体呈圆形或椭圆形，直径50～120 nm。蛋白质印迹法结果显示，外泌体CD63蛋白表达水平为 (3.5±0.4), 高于血细胞的(0.2±0.1), 差异有统计学意义(t=13.304,P<0.01)。见图1。

2.2 sTBI患者与健康人群血浆外泌体miR-202-5p表达水平比较

sTBI患者血浆外泌体miR-202-5p的表达水平为(0.8±0.1), 低于正常群体的(3.7±0.2), 差异有统计学意义(t=12.235,P<0.01)。

2.3 预后良好和预后不良患者一般资料比较

预后不良患者(n=27) GCS评分、miR-202-5p水平及鹿特丹CT评分低于预后良好(n=51)患者, APACHE Ⅱ评分高于预后良好患者，差异均有统计学意义(P<0.05), 而性别、年龄、吸烟、饮酒、基础性疾病、外伤至入院时间及平均动脉压比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.4 sTBI患者预后的多因素Logistic回归分析

将GCS评分、miR-202-5p水平、APACHE Ⅱ评分及鹿特丹CT评分定义为自变量，患者预后定义为应变量进行多因素Logistic回归分析，结果显示, GCS评分、miR-202-5p水平、APACHE Ⅱ评分及鹿特丹CT评分是影响患者预后的独立危险因素(P<0.05), 见表2。

2.5 血浆外泌体miR-202-5p水平与鹿特丹CT评分、GCS评分及APACHE Ⅱ评分的相关性

血浆外泌体miR-202-5p水平与鹿特丹CT评分和GCS评分呈正相关(r=0.703、0.711,P<0.01), 与APACHE Ⅱ评分呈负相关(r=-0.693,P<0.01)。

2.6 血浆外泌体miR-202-5p水平对患者预后的预测价值分析

miR-202-5p预测患者预后的ROC曲线下面积(AUC)、灵敏度及特异度分别为0.744、69.0%及69.0%, 截断值为0.54。APACHE Ⅱ评分的AUC、灵敏度及特异度分别为0.667、74.0%及60.6%。鹿特丹CT评分的AUC、灵敏度及特异度分别为0.611、59.0%及62.0%。GCS评分的AUC、灵敏度及特异度分别为0.672、80.0%及53.5%。见图2。

3 讨 论

sTBI是最严重的颅脑外伤之一，病情危重，发展迅速，预后不佳，因此如何在早期预判疾病进展和评估患者预后，已成为目前国内外研究的热点。miRNA参与多种细胞生物学过程，与多种疾病的发生和预后有关[12]。外泌体是从细胞分泌出来的直径为40～100 nm的膜泡，其内部包含多种信号分子，如蛋白质、miRNAs、神经节苷脂等，且外泌体容易获取，其内部物质稳定性高，已成为生物学标记物理想的载体[13]。近年来，外泌体来源的miRNAs在颅脑外伤中的应用研究越来越多，有文献[14-16]报道，颅脑损伤患者外周血多种miRNAs呈差异表达，并与疾病进展、预后有关，提示外泌体来源的miRNA可用于评估颅脑外伤患者的预后。

表1 预后良好和预后不良患者一般资料比较

表2 sTBI患者预后的多因素Logistic回归分析

动物实验[17]表明，心肌缺血再灌注损伤的大鼠低表达的miR-202-5p和过表达的miR-202-5p可有效抑制心肌梗死和心肌酶表达。覃燕生[18]研究发现，动脉瘤性蛛网膜下腔出血患者血浆外泌体miR-202-5p水平升高，且与疾病严重程度和预后有关。另外，体外实验研究[8]发现, miR-202-5p过表达促进了缺氧/复氧处理N2a细胞的增殖能力，抑制了细胞凋亡，同时显著减少了脑缺血再灌注损伤大鼠模型的梗死面积，但外泌体来源的miR-202-5p与颅脑外伤的关系尚不清楚。本研究结果显示, sTBI患者血浆外泌体miR-202-5p表达水平低于与健康人群，并且预后不良患者miR-202-5p表达水平低于预后良好患者，表明外泌体miR-202-5p的减少与sTBI病情的加重有关，但具体机制有待进一步研究证实。

GCS评分是目前临床常用的评估颅脑外伤患者意识障碍的量表，评分越低，预后越差[19-20]。鹿特丹CT评分是用于评估脑外伤患者脑组织损伤程度的一套影像学评价系统，与患者预后呈负相关[21-22]。APACHE Ⅱ评分是危重病常用评估指标，分数越高，病情越严重。研究[23-24]证实, GCS评分、鹿特丹CT评分及APACHE Ⅱ评分是评估脑外伤患者预后的可靠指标。本研究结果同样证实了上述3个指标也是影响sTBI患者预后的危险因子, miR-202-5p是sTBI患者预后不良的独立预测因素。明确血浆外泌体miR-202-5p与疾病发生、预后有关后，本研究进一步利用ROC曲线分析了miR-202-5p对sTBI患者预后的预测价值，结果发现, miR-202-5p预测患者死亡的AUC为0.744, 具有一定的预测价值。另外, miR-202-5p预测AUC优于GCS评分、鹿特丹CT评分及APACHE Ⅱ评分。因此，血浆外泌体miR-202-5p水平可用于评估sTBI患者预后。

综上所述, sTBI患者血浆外泌体miR-202-5p低表达是预后的独立危险因素，但本研究结果仍需要进一步验证。