apelin受体及其同源二聚体促进血管性痴呆大鼠内源性神经干细胞增殖的研究*

王德秀，李建设，殷 月，高菁婕，王咏婧，蔡 欣△，王玉良△

（1潍坊医学院基础医学院，山东潍坊261053；2潍坊医学院临床医学院，山东潍坊261053；3潍坊医学院生命科学与技术学院，山东潍坊261053）

血管性痴呆（vascular dementia，VD）是由于脑缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）等脑血管疾病引起的机体认知功能障碍综合征［1］。高龄、吸烟、饮酒、高血压、高血脂等易诱发VD，VD患者表现为注意力不集中，认知功能和学习记忆能力下降，对日常工作生活产生严重影响，因此，临床中对VD的发生进行早期诊断和干预治疗是提高患者生存质量，减轻家庭和社会负担的重要措施。

神经干细胞（neural stem cells，NSCs）是一类具有自我更新能力和分化潜能的细胞［2］，近年来研究显示，脑I/R后可引发NSCs增殖［3］，由于I/R后脑组织微环境发生变化，导致NSCs的增殖能力有限，因此如何放大NSCs增殖，对抗脑组织结构和功能损害成为目前研究的重点。

apelin受体APJ是G蛋白偶联受体（G-proteincoupled receptors，GPCRs）家族成员之一，在中枢神经系统内广泛表达，能降低脑I/R导致的细胞凋亡、自噬、炎症以及氧化应激等反应，具有重要的神经保护作用［4］。大量研究表明GPCRs能形成二聚体，参与先兆子痫（血管紧张素Ⅱ1型受体和缓激肽受体B2二聚体）、抑郁症（血清素1A受体和血清素7受体二聚体，甘丙肽受体1型、2型和血清素1A受体二聚体）、精神分裂症（多巴胺D2受体异二聚体）等多种神经系统疾病［5］。

本课题组前期研究表明，APJ能形成同源二聚体，且在VD大鼠中apelin-13能增加APJ同源二聚体的比例，改善VD大鼠的认知功能［6］，但其发挥作用的机制尚不清楚。鉴于大鼠的大脑结构和功能与人类的高度相似，以及大鼠海马对I/R损伤的高度敏感性，大鼠在大量的脑血管疾病研究中广泛应用。本研究利用VD大鼠模型探究APJ单体及其同源二聚体对海马齿状回（dentate gyrus，DG）内源性NSCs增殖的影响，以期为VD发生后中枢神经系统功能重建和神经再生提供参考资料。

材料和方法

1 材料

1.1 实验动物8周龄清洁级雄性SD大鼠60只，体重230～280 g之间，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，许可证号为SCXK（鲁）20190003。

1.2 药物和试剂兔抗caspase-3抗体购自Cell Signaling Technology；鼠抗增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗体购自Abcam；兔抗巢蛋白（nestin）抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamine isothiocyanate，TRITC）标记的山羊抗小鼠Ⅱ抗和异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的山羊抗兔Ⅱ抗均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；增强型化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）发光液购自上海碧云天生物技术有限公司；apelin-13购自Phoenix Pharmahandel。

2 实验方法

2.1 实验动物分组与给药前期研究显示，apelin-13能增加APJ的表达，APJ的高表达促进APJ同源二聚体的表达上调，而APJ的跨膜区1（transmembrane domain 1，TM1）能阻断APJ同源二聚体的形成［7］。因此，添加apelin-13和apelin-13+TM1分别作为APJ同源二聚体组和APJ单体组。将48只大鼠随机分为假手术组、模型组、apelin-13（0.05 mg·kg-1·d-1）组和apelin-13（0.05 mg·kg-1·d-1）+TM1（0.4 mg·kg-1·d-1）组，每组12只。药物组大鼠于造模后7 d通过侧脑室给予不同的药物处理，假手术组和模型组给予等体积生理盐水处理，每天注射1次，连续7 d。

2.2 VD模型的建立利用我们实验室之前的方法［8］建立VD模型，随机选取46只大鼠麻醉后固定，颈部消毒后手术分离双侧颈总动脉，腹腔注射硝普钠溶液（2.5 mg/kg）同时对双侧颈总动脉夹闭再通两次，时间均为10 min，妥善缝合后正常喂养7 d，其余14只大鼠作为假手术组，只分离双侧颈总动脉，不进行颈总动脉夹闭和硝普钠注射。

2.3 Morris水迷宫实验在预温至37℃的水迷宫内放置一隐藏于水中的平台，实验开始前1 d，将大鼠置于不含平台的水池中，让其自由游泳2 min熟悉环境。实验时将大鼠在每象限分别置入水中，记录大鼠逃逸潜伏期（escape latency，EL），大鼠若2 min未登上平台，EL记为2 min并辅助其登上平台，每天实验1次，连续3 d。

2.4 侧脑室注射导管的植入造模后7 d，将大鼠麻醉后固定于小动物脑定位仪上，定位侧脑室位置（以前囟为坐标原点，向后0.8 mm，向右1.6 mm，深度3.8 mm）植入5 mm长的注射套管，利用造牙树脂妥善固定套管于颅骨，缝合切口并给予抗感染措施。

2.5 HE染色大鼠麻醉后分别用生理盐水和4%多聚甲醛灌注，取脑后固定48 h，每组随机选取6只大鼠的脑组织，切取视交叉后4 mm处至小脑前的脑组织，先脱水透明再进行石蜡包埋，然后使用半自动切片机将其切成约5 μm厚度的切片。切片脱蜡入水后进行苏木素染色2 min，染色结束后用蒸馏水冲洗，1%盐酸乙醇溶液分化5 s，碳酸锂饱和溶液返蓝，冲洗后滴加水溶性伊红染色液2 min，乙醇梯度脱水后二甲苯透明2次，每次10 min，中性树胶封片后光镜观察各组海马CA1区并拍照记录、分析病理改变。

2.6 免疫荧光（immunofluorescence，IF）染色取方法2.5制备的大鼠切片每组6～7张，脱蜡入水，微波抗原修复后正常山羊血清封闭，将兔抗nestin抗体（1∶25）和鼠抗PCNA抗体（1∶200）混合4℃过夜孵育，0.01 mmol/L pH 7.45的磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）洗涤3次，每次5 min，均匀混合滴加TRITC标记山羊抗小鼠Ⅱ抗（1∶100）和FITC标记山羊抗兔Ⅱ抗（1∶100），37℃孵育1 h，PBS洗涤3次，每次5 min，利用含4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）的抗淬灭封片剂封片后于荧光显微镜下拍照。

2.7 Western blot实验大鼠麻醉后断头，于冰上取出海马组织，快速剪碎后加入预先配制并预冷的含苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）的RIPA裂解液中，于冰上充分匀浆，4℃、13 700×g离心力下离心15 min后取一定量上清检测蛋白浓度，将SDS-PAGE蛋白上样缓冲液加入其余上清液中，在95℃水浴中放置10 min得到变性蛋白，调齐蛋白浓度后以每孔50 μg蛋白质量进行SDS-PAGE，电泳结束后转膜。在室温的条件下用5%脱脂奶粉封闭1 h，加入兔抗nestin抗体（1∶1 000）、鼠抗PCNA抗体（1∶5 000）和兔抗caspase-3抗体（1∶1 000），4℃过夜，TBST洗涤3次，每次5 min，分别加入辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊抗兔（1∶2 000）和山羊抗鼠（1∶3 000）Ⅱ抗，室温孵育1 h，再用含Tween-20的Tris缓冲液（Tris buffer soulution，TBS）洗涤3次，每次5 min，最后均匀滴加ECL发光液，利用化学发光仪拍照并分析灰度。

3 统计学分析

利用SPSS 22.0软件分析实验数据，以均数±标准差（mean±SD）表示计量资料，采用F检验进行多组间比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 APJ单体和同源二聚体改善VD大鼠学习记忆能力

46只大鼠进行VD模型制备，术后存活率为87.0%，模型成功率为82.6%。VD模型建立后，各组大鼠分别给予不同药物经侧脑室注射7 d后进行Morris水迷宫实验，结果显示，模型组大鼠EL较假手术组显著延长（P＜0.01）；而apelin-13组和apelin-13+TM1组大鼠的EL较模型组均显著缩短（P＜0.05），但仍长于假手术组（P＜0.05），见图1。

2 APJ单体和同源二聚体减轻VD大鼠海马CA1区神经元损伤

Figure 1.APJ monomer and its homodimer improved learning and memory ability in VD rats.The escape latency of rats measured by Morris water maze at 15 days after cerebral ischemia/reperfusion.Mean±SD.n=12.*P＜0.05，**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs VD group.图1 APJ单体和同源二聚体对VD大鼠认知功能的影响

HE染色结果显示，与假手术组相比，VD模型组、apelin-13组和apelin-13+TM1组中大鼠海马CA1区锥体神经元均出现不同程度的病理损伤，且可以显著地观察到模型组细胞排列不规则，细胞核发生固缩，锥体细胞带出现断裂，细胞数目显著减少（P＜0.01）；而与VD模型组相比，apelin-13和apelin-13+TM1组中锥体神经元损伤程度较轻，存活的神经元数目较多（P＜0.01），排列较整齐，且apelin-13组锥体神经元的存活数目多于apelin-13+TM1组（P＜0.01），但仍少于假手术组（P＜0.05），见图2。

3 APJ单体和同源二聚体组大鼠海马DG区存在增殖的内源性NSCs

PCNA/nestin免疫荧光双重标记实验结果显示，VD模 型组，apelin-13组和apelin-13+TM1组大鼠 于脑I/R后14 d海马DG区均出现PCNA+nestin+DAPI+细胞，见图3。

4 APJ单体和同源二聚体降低VD大鼠海马区cleaved caspase-3蛋白水平

Western blot实验结果显示，VD模型组大鼠海马区cleaved caspase-3的水平较假手术组显著升高（P＜0.01），而apelin-13组 和apelin-13+TM1组cleaved caspase-3的水平均较模型组显著降低（P＜0.01），但apelin-13+TM1组cleaved caspase-3水平显著高于apelin-13组（P＜0.01），见图4。

5 APJ单体和同源二聚体促进VD大鼠海马区nestin和PCNA蛋白的表达

利用Western blot检测各组大鼠海马组织内nestin和PCNA的表达，结果显示，与假手术组相比，VD模型组、apelin-13组和apelin-13+TM1组大鼠海马区nestin和PCNA的表达水平均显著升高（P＜0.01），apelin-13组和apelin-13+TM1组的表达均较模型组增多（P＜0.01），且apelin-13组高于apelin-13+TM1组（P＜0.01），见图5。

Figure 2.After APJ monomer and homodimer treatment，the injury degree of pyramidal neurons in hippocampal CA1 area of VD rats decreased.Morphological structure of HE staining in neurons of hippocampal CA1 area of rats at 15 d after cerebral ischemia/reperfusion was shown.The scale bar=50 μm.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs VD group；△△P＜0.01 vs apelin-13 group.图2 APJ单体和同源二聚体减轻VD大鼠海马CA1区神经元损伤

讨 论

VD作为仅次于阿尔茨海默病的第二大痴呆性疾病，随着人口老龄化程度的不断加剧，其发病率也逐年升高，目前尚无有效的治疗手段。1992年Reynolds等［9］首次从成年小鼠纹状体内分离出内源性NSCs，并在体外增殖及分化为神经元和星形胶质细胞。近年来随着研究的不断深入，已有研究证明在成年哺乳动物侧脑室室管膜下区（subventricular zone，SVZ）和海马DG区的颗粒下区（subgranular zone，SGZ）存在NSCs，且这两个区域内的NSCs在一定条件下能够发生增殖、迁移和分化［10］。由于内源性NSCs来源清晰，无排异性及低污染性，因此成为当下治疗脑I/R类疾病的热点。受制于内源性NSCs增殖数量有限，寻找能够促进内源性NSCs增殖和神经再生的方法及手段，对于修复脑组织结构和功能损伤具有重要意义。

Figure 3.After APJ monomer and homodimer treatment，the proliferation of endogenous neural stem cells（NSCs）in hippocampal DG area of VD rats increased.Immunofluorescence staining results of PCNA，nestin and DAPI in hippocampal DG area of rats in each group at 15 d after cerebral ischemia/reperfusion were shown.The scale bar=200 μm.PCNA labeled proliferating cells with green nuclei；nestin labeled neurofilament protein with red cytoplasm；DAPI labeled blue nuclei；PCNA+nestin+DAPI+cells（yellow fluorescence）were proliferating NSCs.图3 APJ单体和同源二聚体对VD大鼠海马DG区内源性NSCs增殖的影响

Figure 4.APJ monomer and homodimer decreased the protein level of cleaved caspase-3 in the hippocampus of VD rats.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs VD group；△△P＜0.01 vs apelin-13 group.图4 APJ单体和同源二聚体对VD大鼠海马区cleaved caspase-3蛋白水平的影响

Figure 5.APJ monomer and homodimer increased the protein levels of PCNA and nestin in hippocampus of VD rats by Western blot.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs VD group；△△P＜0.01 vs apelin-13 group.图5 APJ单体和同源二聚体对VD大鼠海马区PCNA和nestin蛋白表达水平的影响

GPCRs是已知的体内最大的受体超家族，同时也是具有重要意义的药物靶点，影响NSCs的增殖和分化，如多巴胺D1受体活性被抑制后能够促进人NSCs的增殖并阻碍其分化［11］。研究显示，GPCRs二聚体在神经系统中发挥着重要作用［12］，5-羟色胺1A受体与食欲素1型受体形成二聚体后参与抑郁的发生过程［13］，糖皮质激素受体二聚体与小鼠的认知功能有关［14］，在小胶质细胞中，大麻素受体（cannabinoid receptors，CBRs）的大麻素1型受体（cannabinoid type 1 receptor，CB1R）和大麻素2型受体（cannabinoid type 2 receptor，CB2R）可形成异源二聚体，有望成为阿尔茨海默病的治疗靶点［15］。

本课题组前期研究表明，APJ能形成同源二聚体且具有与单体不同的功能［7］。本实验的水迷宫检测结果表明，APJ同源二聚体和单体均能改善VD大鼠的认知功能，且APJ同源二聚体的效果优于单体，这说明APJ同源二聚体比单体具有更强的神经保护作用。海马CA1区是脑内参与记忆贮存功能的重要部分之一［16］，海马区的神经元，特别是海马CA1区的锥体神经元对缺血和缺氧表现得非常敏感［17］，本研究HE染 色结果 表明，apelin-13和apelin-13+TM1能 显著减轻脑I/R引起的锥体神经元损伤，增加神经元存活的数目。为了进一步验证APJ单体和同源二聚体的保护作用，本实验利用Western blot对cleaved caspase-3的表达进行检测，结果也充分表明，APJ同源二聚体和单体均能降低VD大鼠海马CA1区锥体神经元的凋亡，且APJ同源二聚体组抗凋亡效果优于单体组。

PCNA作为一种细胞核定位蛋白，在生理条件下仅在增殖细胞中合成和表达，并参与损伤DNA链的修复，是评价细胞增殖状态和DNA修复的重要指标［18］，nestin则为NSCs的特异性标志物。基于此，本研究利用PCNA/nestin免疫荧光双重标记实验观察各组大鼠海马DG区NSCs增殖情况，利用Western blot检测各组大鼠海马区nestin和PCNA的表达，结果表明，APJ单体和同源二聚体均能增加VD大鼠海马区nestin和PCNA的表达，促进VD大鼠海马DG区NSCs的增殖，放大脑I/R后的神经再生，且APJ同源二聚体的促增殖能力强于单体。

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族由细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）、细胞外信号调节激酶5（extracellular signal-regulated kinase 5，ERK5）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和p38 MAPK组成，MAPK信号通路介导细胞内的信号传导，并参与神经元的生长和分化［19］。研究表明，apelin通过MAPK信号通路诱导人视网膜色素上皮细胞中细胞骨架和紧密连接蛋白的表达，促进人视网膜色素上皮细胞的增殖和迁移［20］，apelin也能够经MAPK信号通路介导缺氧诱导的内皮祖细胞增殖［21］，由此我们推测APJ同源二聚体也能经MAPK信号通路发挥作用。KRAB相关蛋白1（KRAB-associated protein 1，KAP1）参与调节胚胎干细胞周期，控制细胞增殖和凋亡［22］。KAP1的翻译后修饰，包括磷酸化和泛素化，对于胚胎发育和免疫调节至关重要。研究报道，磷酸化的KAP-1能与PCNA相互作用以恢复S期DNA复制后的异染色质［23］，还能在DNA损伤后招募DNA修复相关因子，以促进DNA修复［24］。据此我们推测，APJ单体和同源二聚体可能是经MAPK信号通路激活KAP1的磷酸化，增加PCNA的表达，参与DNA的损伤修复，同时促进VD大鼠海马DG区NSCs的增殖从而发挥神经保护作用，具体机制我们将进一步研究。

综上所述，APJ同源二聚体和单体均能改善VD大鼠的认知水平，延缓海马CA1区锥体神经元的凋亡，并且APJ同源二聚体的效果优于单体，其机制可能与促进VD大鼠海马DG区NSCs的增殖有关，具体机制我们将进一步探寻。