miR-409-3p通过抑制PIK3CA介导的自噬增强耐药卵巢癌细胞对顺铂的敏感性*

廖凤儿，陶 莹，骆 婕，李 筠，郭 琴

（广东药科大学附属第一医院妇产科，广东 广州 510062）

卵巢癌是我国最常见的妇科恶性肿瘤［1］。手术切除及术后辅以紫杉醇或铂类药物为主的化疗是标准的卵巢癌治疗方法［2］。化疗耐药性会制约化疗效果，并且这种耐药性往往也存在交叉性耐药，此时更换或联合其他种类化疗药物也难以使病人获益［3-4］。因此，寻找能使得卵巢癌耐药细胞重新恢复化疗敏感性的方法具有重要意义。

既往研究报道，微小RNA（microRNA，miRNA，miR）在肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移及化疗耐药等生物学行为的调控中发挥着关键作用［5-6］。miR-409-3p已被发现可抑制胃癌、肝癌和乳腺癌等多种癌症的发生和进展［7-9］。另外，miR-409-3p可通过靶向beclin-1逆转结直肠癌细胞的奥沙利铂耐药性［10］。然而，miR-409-3p在卵巢癌中对顺铂敏感性的影响仍不清楚。因此，本研究探讨miR-409-3p对卵巢癌细胞顺铂敏感性的影响，并分析可能的机制。

材料和方法

1 材料

卵巢癌细胞株SKOV3和A2780（武汉普诺赛生命科技有限公司）；耐顺铂卵巢癌细胞株SKOV3/DDP和A2780/DDP（上海信裕生物技术有限公司）；胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司）；青霉素/链霉素和DMEM培养液（Thermo Fisher Scientific）；顺铂（纯度99.95%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；雷帕霉素（rapamycin，Rap；纯度＞99%，Selleck）；WST-1比色法细胞活力定量试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司）；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）；Cyto-ID细胞自噬检测试剂盒（Enzo Life Sciences）；Hiperfect转染试剂、RNeasy试剂盒、Omniscript RT试剂盒和Taq PCR Master Mix试剂盒（Qiagen）；野生型（wild-type，WT）和突变型（mutant，MUT）磷脂酰肌醇3-激酶催化亚基α（phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit α，PIK3CA）3′UTR萤光素酶表达载体、miR-NC及miR-409-3p mimics由上海生工生物工程有限公司构建；si-NC、si-PIK3CA、pcDNA-NC、pcDNA-PIK3CA、携带miR-NC的慢病毒（lentivirus，LV）载 体（LV-miR-NC）、LV-miR-409-3p mimics和LVPIK3CA由广州锐博生物科技有限公司构建；beclin-1和SQSTM1抗体（Cell Signaling Technology）；LC3和PIK3CA抗体（Arigo Biolaboratories）；GAPDH抗体和HRP标记的羊抗兔IgG（上海碧云天生物技术有限公司）。

2 方法

2.1 临床样本收集选取接收肿瘤切除术且在术后给予以铂类药物为主的标准流程化疗方案的II～III期卵巢癌患者。收集受试者的切除癌组织与癌旁组织（约距癌浸润边缘2 cm，并经病理验证为非肿瘤组织）。其中，在化疗后6个月内复发的受试者的癌组织定义为化疗耐药组织，6个月未复发的受试者的癌组织定义为化疗敏感组织。本研究共纳入16例化疗敏感癌组织和10例化疗耐药癌组织，同时纳入对应的癌旁非肿瘤组织。将组织样品快速冷冻并储存在-80℃，备用。本研究通过广东药科大学附属第一医院伦理委员会批准，采集样本的受试者均签署书面知情同意。

2.2 细胞培养SKOV3和A2780细胞种植在含有10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM培养液中，SKOV3/DDP和A2780/DDP细胞种植在含有20 mg/L顺铂、10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM培养液中，在37℃、5%CO2的条件下培养。

2.3 RT-qPCR检测miR-409-3p表达使用RNeasy试剂盒从组织和细胞中提取总RNA。利用Omniscript RT试剂盒逆转录为cDNA。然后根据Taq PCR Master Mix试剂盒说明书步骤，以cDNA为模板进行RT-qPCR分析。miR-409-3p的上游引物序列为5′-GCGAATGTTGCTCGGTGA-3′，下游引物序列为5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；内参照U6的上游引物序列为5′-GCTTCGGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物序列为5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。RT-qPCR循环条件为：95℃20 s，然后40个循环（95℃15 s，58℃1 min）。采用2-ΔΔCt法分析miR-409-3p相对表达量。

2.4 靶基因预测与验证用starBase在线数据库（http://starbase.sysu.edu.cn/）预测PIK3CA为miR-409-3p的潜在靶基因之一。根据预测结合的序列构建WT和MUT PIK3CA 3′UTR萤光素酶表达载体，然后根据双萤光素酶报告基因试剂盒指示步骤，将其分别与miR-409-3p mimic和miR-NC转入细胞，转染48 h后，用PBS洗2次，加入底物，用发光仪测定发光强度，并计算相对萤光素酶活性。

2.5 细胞转染与药物处理分别取对数生长期的SKOV3/DDP和A2780/DDP细胞，按照说明书指示步骤，用Hiperfect转染试剂分别将miR-NC或miR-409-3p mimics、si-NC或si-PIK3CA、pcDNA-NC或pcDNAPIK3CA转入细胞，培养48 h。用（或不用）终浓度100 nmol/L的Rap处理上 述 细胞30 min后，收集 细胞，用于后续实验。

2.6 细胞活力检测细胞均以10000细胞/孔的密度接种于96孔细胞培养板，并分别给予2.5、5、10、20、40和80 mg/L的顺铂中培养2 d。参照WST-1比色法定量试剂盒说明书步骤，采用酶标仪在450 nm处的吸光度值。

2.7 细胞凋亡检测细胞均以3.5×105个细胞/孔的密度接种于6个孔板上，并给予20 mg/L顺铂培养2 d。按照说明书指示步骤，在避光条件下，用Annexin V-FITC和PI试剂孵育细胞15 min。用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

2.8 Cyto-ID染色取处理后的细胞接种于激光共聚焦培养皿中并待细胞贴壁后，按照说明书指示步骤，用Cyto-ID绿色染料标记自噬小泡，然后用Hoechst 33342标记细胞核，用激光共聚焦显微镜观察并获取Cyto-ID阳性斑点图像，并用Adobe Photoshop CC软件计数每个细胞中Cyto-ID阳性斑点数，每个视野至少计数20个细胞。

2.9 Western blot取人组织和细胞样品，在4℃下用RIPA裂解萃取蛋白质。蛋白质定量后，用快速蛋白免疫转印系统进行转印。将其转印于PVDF膜的蛋白用5%脱脂奶粉封闭1 h后，按抗体说明书的稀释比例，分别孵育beclin-1、SQSTM1、LC3、PIK3CA和GAPDH抗体，4℃过夜。TBST洗5 min×3次，孵育HRP-羊抗兔IgG二抗，室温1 h。通过增强的化学发光试剂显影。以GAPDH为内部参照，利用Image J软件分析蛋白相对表达量。

2.10 裸鼠荷瘤实验此实验由威斯腾生物医药科技有限公司完成。分别将稳转LV-miR-NC、LV-miR-409-3p mimics及LV-miR-409-3p mimics+PIK3CA（共转染）的SKOV3/DDP细胞用PBS制备成1×1010L-1的细胞悬液，取150 μL接种至BALB/c裸鼠右腋皮下。小鼠分别给予或未给予腹腔注射顺铂（5 mg/kg，每周3次，持续4周）和/或Rap（2 mg/kg，每天1次，持续4周），每周用游标卡尺测量瘤体长径和短径，并计算瘤体体积（瘤体体积=长径×短径2/2）。第4周末，麻醉小鼠，收集瘤体，按照常规法将瘤体组织用石蜡包埋，并切片（4 μm）。切片经脱蜡、水化、抗原修复与封闭后，按照免疫组化SABC法进行操作，显微镜下观察瘤体组织中beclin-1和PIK3CA的表达情况。

3 统计学分析

采用GraphPad Prism 6软件进行统计分析。计量资料采用均数±标准差（mean±SD）描述。两组间差异比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，多组间均数两两事后比较用Bonferroni校正法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 耐药卵巢癌组织和细胞中miR-409-3p表达下调

与癌旁组织比较，化疗敏感和耐药卵巢癌组织中miR-409-3p表达水平均显著降低（P＜0.05），且耐药卵巢癌组织中miR-409-3p表达水平较敏感组织显著降低（P＜0.05），见图1A。在卵巢癌细胞系中，耐顺铂细胞系SKOV3/DDP和A2780/DDP中miR-409-3p表达水平均显著低于其亲本细胞（P＜0.05），见图1B。

Figure 1.Expression of miR-409-3p in ovarian cancer tissues and cells.A：miR-409-3p expression levels in chemosensitive tumor（T）tissues（n=16），chemo-resistant T tissues（n=10）and their corresponding adjacent non-tumor（N）tissues；B：miR-409-3p expression levels in SKOV3，SKOV3/DDP，A2780 and A2780/DDP cells（n=3）.Mean±SD.*P＜0.05 vs N；#P＜0.05 vs sensitive；△P＜0.05 vs SKOV3 cells；▲P＜0.05 vs A2780 cells.图1卵巢癌组织和细胞中miR-409-3p表达情况

2 miR-409-3p提高耐药卵巢癌细胞的顺铂敏感性

与miR-NC组比较，miR-409-3p mimics组SKOV3/DDP和A2780/DDP细胞的活力（图2A、B）均显著降低（P＜0.05），凋亡比例（图2C）均显著升高（P＜0.05）。

3 miR-409-3p抑制自噬

Figure 2.Over-expression of miR-409-3p reduced cisplatin resistance.A and B：the viability of A2780/DDP（A）and SKOV3/DDP（B）cells was detected by WST-1 assay；C：the apoptosis of A2780/DDP and SKOV3/DDP cells was detected by flow cytometry.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs miR-NC group.图2过表达miR-409-3p降低顺铂耐药性

Cyto-ID染色结果（图3A）显示，与miR-NC组比较，miR-409-3p mimics组SKOV3/DDP和A2780/DDP细胞中平均每个细胞的Cyto-ID染色斑点数均显著降低（P＜0.05）。Western blot检测自噬相关蛋白结果（图3B）显示，与miR-NC组比较，miR-409-3p mimics组SKOV3/DDP和A2780/DDP细 胞 中beclin-1表达水平和LC3-II/LC3-I比值均显著降低（P＜0.05），SQSTM1表达水平均显著升高（P＜0.05）。

4 自噬诱导剂Rap能消除miR-409-3p的顺铂增敏作用

WST-1实验（图4A、B）和流式细胞术（图4C）结果显示，与miR-409-3p mimics组比较，miR-409-3p mimics+Rap组SKOV3/DDP和A2780/DDP细胞活力均显著升高（P＜0.05），凋亡率均显著降低（P＜0.05）。

5 miR-409-3p靶向抑制PIK3CA表达

生物信息学预测PIK3CA与miR-409-3p存在潜在结合序列（图5A）。双萤光素酶报告基因结果（图5B）显示，在转染WT PIK3CA 3′UTR萤光素酶表达载体的细胞，与miR-NC组比较，miR-409-3p mimics组相对萤光素酶活性显著降低（P＜0.05）；而在转染MUT PIK3CA 3′UTR萤光素酶表达载体的细胞，miRNC组的相对萤光素酶活性与miR-409-3p mimics组无显著差异（P＞0.05）。Western blot结果显示，与化疗敏感组织或敏感细胞比较，耐药组织（图5C）和耐顺铂细胞（图5D）中PIK3CA蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）；与miR-NC组比较，miR-409-3p mimics组SKOV3/DDP和A2780/DDP细胞中PIK3CA蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05），见图5E。

6 敲减PIK3CA能抑制卵巢癌细胞自噬并增强其对顺铂的敏感性

Cyto-ID染色结果（图6A）显示，与si-NC组比较，si-PIK3CA组SKOV3/DDP和A2780/DDP细胞中平均每个细胞的Cyto-ID染色斑点数均显著降低（P＜0.05）。Western blot检测自噬相关蛋白结果（图6B）显示，与si-NC组比较，si-PIK3CA组SKOV3/DDP和A2780/DDP细胞中beclin-1表达水平和LC3-II/LC3-I比值均显著降低（P＜0.05），SQSTM1表达水平均显著升高（P＜0.05）。WST-1（图7A、B）和流式细胞术（图7C）结果显示，与si-NC组比较，si-PIK3CA组SKOV3/DDP和A2780/DDP细胞活力均显著降低（P＜0.05），凋亡比例均显著升高（P＜0.05）。

Figure 3.Over-expression of miR-409-3p reduced autophagy of drug-resistant ovrian cancer cells.A：Cyto-ID staining of A2780/DDP and SKOV3/DDP cells（scale bar=10 μm）；B：the expression levels of autophagy-related proteins beclin-1，LC3 and SQSTM1 in A2780/DDP and SKOV3/DDP cells were detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs miR-NC group.图3过表达miR-409-3p降低耐药卵巢癌细胞自噬水平

Figure 4.Rapamycin（Rap）eliminated the sensitizing effect of miR-409-3p on drug-resistant ovrian cancer cells to cisplatin.A and B：the viability of A2780/DDP（A）and SKOV3/DDP（B）cells was detected by WST-1 assay；C：the apoptosis of A2780/DDP and SKOV3/DDP cells was detected by flow cytometry.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs miR-409-3p mimics group.图4雷帕霉素消除miR-409-3p对耐药卵巢癌细胞的顺铂增敏作用

Figure 5.PIK3CA was the target gene of miR-409-3p.A：predicted PIK3CA binding sequence to miR-409-3p；B：luciferase activity detection to validate the binding relationship（n=3）；C：the expression levels of PIK3CA in chemosensitive tumor（T）tissues（n=16），chemoresistant T tissues（n=10）and their corresponding adjacent non-tumor（N）tissues；D：the expression levels of PIK3CA in SKOV3，SKOV3/DDP，A2780 and A2780/DDP cells（n=3）；E：the expression levels of PIK3CA in A2780/DDP and SKOV3/DDP cells from miR-NC and miR-409-3p mimics groups（n=3）.Mean±SD.*P＜0.05 vs miR-NC group；#P＜0.05 vs N；&P＜0.05 vs sensitive；△P＜0.05 vs A2780 cells；▲P＜0.05 vs SKOV3 cells.图5 PIK3CA为miR-409-3p的靶基因

7 过表达PIK3CA能消除miR-409-3p的抑制自噬和顺铂增敏的作用

Western blot结果（图8A）显示，与miR-409-3p mimics+pcDNA-NC组 比 较，miR-409-3p mimics+pcDNA-PIK3CA组SKOV3/DDP和A2780/DDP细胞中PIK3CA和beclin-1表达水平及LC3-II/LC3-I比值均显著升高（P＜0.05），SQSTM1表达水平均显著降低（P＜0.05）。Cyto-ID染色结果（图8B）显示，与miR-409-3p mimics+pcDNA-NC组 比较，miR-409-3p mimics+pcDNA-PIK3CA组SKOV3/DDP和A2780/DDP细胞中平均每个细胞的Cyto-ID染色斑点数均显著增加（P＜0.05）。WST-1（图9A、B）和流式细胞术（图9C）结果显示，与miR-409-3p mimics+pcDNA-NC组比较，miR-409-3p mimics+pcDNA-PIK3CA组SKOV3/DDP和A2780/DDP细胞活力均显著升高（P＜0.05），凋亡率均显著降低（P＜0.05）。

8 miR-409-3p、PIK3CA和顺铂对SKOV3/DDP细胞移植瘤小鼠荷瘤生长的影响

游标卡尺测量的瘤体体积结果（图10A）显示，与对照组比较，LV-miR-409-3p mimics组和单独顺铂组的瘤体体积均显著减小（P＜0.05）；与单独顺铂组比较，顺铂+LV-miR-409-3p mimics组的瘤体体积显著减小（P＜0.05）；与顺铂+LV-miR-409-3p mimics组比较，顺铂+LV-miR-409-3p mimics+Rap组和顺铂+LV-miR-409-3p mimics+PIK3CA组的瘤体体积均显著增大（P＜0.05）。第4周分离的瘤体的照片也显示出与游标卡尺测量的瘤体体积相似的结果，顺铂+LV-miR-409-3p mimics组瘤体显示的体积最小（图10B）。免疫组织化学染色结果（图10C）显示，顺铂+LV-miR-409-3p mimics+Rap组和顺铂+LV-miR-409-3p mimics+PIK3CA组瘤体组织中PIK3CA和beclin-1阳性染色范围广且染色强度高，但LV-miR-409-3p mimics组和顺铂+LV-miR-409-3p mimics组瘤体组织中PIK3CA和beclin-1阳性染色范围小（甚至部分视野未见阳性染色）且染色强度低。

Figure 6.Knockdown of PIK3CA reduced autophagy level.A：Cyto-ID staining of A2780/DDP and SKOV3/DDP cells（scale bar=10 μm）；B：the expression levels of autophagy-related proteins beclin-1，LC3 and SQSTM1 in A2780/DDP and SKOV3/DDP cells were detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs si-NC group.图6敲减PIK3CA降低细胞自噬水平

Figure 7.Knockdown of PIK3CA enhanced cisplatin sensitivity.A and B：the viability of A2780/DDP（A）and SKOV3/DDP（B）cells was detected by WST-1 assay；C：the apoptosis of A2780/DDP and SKOV3/DDP cells was detected by flow cytometry.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs si-NC group.图7敲减PIK3CA增强顺铂敏感性

Figure 10.miR-409-3p increased the sensitivity of SKOV3/DDP cells to cisplatin in vivo.A：changes of the tumor volume in each group；B：photographs of the isolated tumors in each group；C：representative immunohistochemical staining images of PIK3CA and beclin-1 in isolated tumor tissues of each group.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs cisplatin group；&P＜0.05 vs cisplatin+LV-miR-409-3p mimics group.图10 miR-409-3p增加SKOV3/DDP细胞在体内对顺铂的敏感性

讨 论

在肿瘤的研究中，许多影响肿瘤发生、发展和化疗药物敏感性的癌基因和抑癌基因都受到miRNAs的调控，故这些miRNAs可能成为新的治疗靶点［5-6，11］。miR-409-3p已被报道在多种肿瘤中可作为肿瘤抑制因子［7-9］。近来研究发现，过表达miR-409-3p可部分恢复结直肠癌耐药细胞对顺铂的敏感性［10］。尽管miR-409-3p已被证明在多种肿瘤的发生发展过程中具有调控功能，但其在卵巢癌中对顺铂化疗的具体作用尚不清楚。本研究结果显示，miR-409-3p能增强卵巢癌耐药细胞对顺铂的敏感性。

自噬参与调控肿瘤的化疗的敏感性。一些研究显示，自噬能在肿瘤细胞化疗中对化疗剂诱导的凋亡起着协同作用［12-13］。但更多的研究支持自噬在肿瘤细胞（特别是在实体肿瘤细胞）中主要表现为对化疗剂导致的凋亡起拮抗作用，起到降低化疗敏感性的效应［14-16］。推测造成这种现象的差异可能是因为不同种类的细胞的自噬阈值以及的应激条件的不同。另外，顺铂在杀伤卵巢癌A2780细胞的同时也能引起自噬，继而发生耐药［17］。本研究探索了miR-409-3p对自噬的影响。其中，beclin-l参与了从自噬体的形成到自噬溶酶体的成熟的途径中的每一个重要步骤，是自噬激活的关键分子［18］；自噬小体中的LC3-II是细胞发生自噬的分子标志，LC3-II/LC3-I比值可反映自噬的水平［19］；SQSTM1与泛素化蛋白结合，再与定位于自噬小体内膜上的LC3-II蛋白形成复合物，在自噬溶酶体内降解，进而促进自噬［18-19］。本研究显示，在耐药卵巢癌组织和细胞中beclin-1表达水平和LC3-II/LC3-I比值升高，而SQSTM1表达水平降低，提示自噬活性增强；外源性过表达miR-409-3p能抑制耐药卵巢癌细胞的自噬，而激活自噬能消除miR-409-3p的功能，提示miR-409-3p能通过抑制自噬进而恢复耐药卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。

miRNAs可通过转录后水平负向调控靶基因的表达来广泛参与细胞的生长、增殖、分化和凋亡等生理病理过程［5-6］。本研究借助生物信息学分析显示miR-409-3p与PIK3CA存在靶向结合序列，进一步研究得出PIK3CA是miR-409-3p的直接调控靶点。PIK3CA可通过AKT/mTOR信号激活自噬［20-21］。本研究显示，敲减PIK3CA能抑制耐药卵巢癌细胞自噬，而过表达PIK3CA能消除miR-409-3p抑制自噬和顺铂增敏的作用，说明miR-409-3p可通过靶向PIK3CA而抑制促存活自噬，进而恢复耐药卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。

综上所述，miR-409-3p可通过抑制PIK3CA介导的自噬在耐药卵巢癌细胞中发挥顺铂增敏作用。