FAM3C介导TGF-β1诱导的人血管平滑肌细胞表型转换、活力增强及迁移*

訾亚飞，王正力，訾亚婉，李雅馨，刘杨东，赵 渝△

（1重庆医科大学附属第一医院血管外科，重庆 400016；2重庆医科大学附属第一医院呼吸及重症医学科，重庆 400016；3深圳大学附属华南医院血管外科，广东深圳 518100）

内膜增生（intimal hyperplasia）是一种特别的血管重塑状态，发生于动静脉内瘘、动脉粥样硬化及血管再狭窄病变［1-2］。而引起内膜增生的主要原因是由于血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）在多种信号分子［如转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）］刺激下，由收缩表型［标志物为α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）］转化为合成表型［标志物为骨桥蛋白（osteopontin，OPN）及波形蛋白（vimentin）等］，且自身发生肥大及活力增强，并由中膜迁移至内膜引起血管内膜增生［1-3］。虽然目前对VSMCs表型转换有较多研究，但其有效治疗靶点仍不清楚。

序列相似家族3成员C（family with sequence similarity 3 member C，FAM3C）又称白细胞介素样上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）诱导因子（interleukin-like EMT inducer，ILEI）［4］，是FAM3家族的成员，也是重要的细胞因子样蛋白。研究表明，FAM3C在组织中普遍表达［5］，由细胞内分泌至细胞外，并且在多种癌细胞中高表达，促进癌症进展和转移，而循环中的FAM3C是自噬和癌症的生物标志物［6-8］。另外，FAM3C作为TGF-β1的靶基因，其蛋白参与TGF-β1在肾小管上皮细胞及癌症中诱导的EMT，其下调可抑制TGF-β1诱导的改变［9-10］。还有研究提示，FAM3C通过降低糖异生和脂肪相关基因的mRNA和蛋白水平而抑制糖异生，从而减轻肥胖小鼠的胰岛素抵抗、高血糖及脂肪变性［11］。不仅如此，FAM3C还参与成骨细胞的分化［12］。然而，FAM3C是否参与TGF-β1诱导的VSMCs表型转换尚未见报道。

蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可被许多生长因子和细胞因子以磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）依赖的方式激活［13］。Akt是一种重要的细胞内分子，其激活对细胞存活和凋亡有重要影响，并在心血管疾病中调节多种细胞功能［14］。有研究报道Akt活化在TGF-β1促进VSMCs表型转换及增殖的过程中起着重要作用［15-16］，而抑制Akt的激活可减轻血管重构［17］。

本研究旨在探讨FAM3C在TGF-β1诱导VSMCs表型转换、活力增强及迁移中的作用及其潜在机制，以期获得干预内膜增生的相关靶点。

材料和方法

1 材料与试剂

原代人主动脉平滑肌细胞（HTX3138）购自深圳豪地华拓生物科技有限公司；DMEM/F12培养液购自Gibco；胎牛血清购自Biosharp；青霉素和链霉素（C0222）购自碧云天；TGF-β1（100-21-2）购自杭州联科生物技术股份有限公司；CCK-8（AR1160）购自武汉博士德生物工程有限公司；Akt inhibitor VIII（Akti-VIII；T3346）购自TargetMol；FAM3C小干扰RNA（si-FAM3C）和阴性对照小干扰RNA（si-NC）均由广州锐博生物技术有限公司合成；jetPRIME transfection reagent（101000046）购自Polyplus；FAM3C过表达慢病毒（LV-FAM3C）及空载病毒（LV-GFP）由赛业（苏州）生物科技有限公司合成；Transwell小室购自Corning；增强化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）显影试剂盒（4AW011-500）购自北京四正柏生物科技有限公司；OPN兔抗（22952-1-AP）和辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG（SA00001-1）购自Proteintech；vimentin鼠抗（BF8006）、FAM3C兔抗（DF12605）、α-SMA兔抗（AF1032）、Akt兔抗（AF0836）、磷酸化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）兔抗（AF0016）及β-actin兔抗（AF7018）购自Affinity；增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗体（D3H8P）购自Cell Signaling Technology；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（A21020）、荧光标记的山羊抗兔IgG（A23420）及荧光标记的山羊抗鼠IgG（A23210）购自Abbkine。

2 主要方法

2.1 细胞培养及处理原代人VSMCs用DMEM/F12培养液加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素在37℃及5%CO2环境下培养。首先用不同浓度（0、1、2、5及10 μg/L）的TGF-β1作用24 h和10 μg/L的TGF-β1作用不同时间（0、6、12、24及48 h），以确定最佳作用浓度和时间，并以10 μg/L的TGF-β1作用不同时间（0、6、12及24 h）来诱导VSMCs表型转换。在验证敲减FAM3C效率的实验中，将细胞分为control（CTL）组、si-NC组和si-FAM3C组，之后再分为si-NC组、si-NC+TGF-β1组、si-FAM3C组和si-FAM3C+TGF-β1组；在荧光显微镜下验证过表达慢病毒是否转染成功的实验中，将细胞分为空白（blank）组、LVGFP组和LV-FAM3C组，之后再分为LV-GFP组、LVGFP+TGF-β1组、LV-FAM3C组和LV-FAM3C+TGF-β1组；在Akt抑制剂处理的实验中，将细胞分为LV-GFP组、LV-GFP+TGF-β1组、LV-FAM3C组、LV-FAM3C+TGF-β1组、LV-FAM3C+Akti-VIII组 和LV-FAM3C+TGF-β1+Akti-VIII组，Akti-VIII（5 μmol/L）提前2 h加入处理组。各组处理前均饥饿细胞24 h。

2.2 细胞活力的测定以每孔1×104细胞在96孔板种板孵育。细胞贴壁后根据分组进行处理，同时设置空白对照组及5个复孔。次日按照CCK-8试剂盒说明书，在各孔加入10 μL CCK-8溶液，37℃避光孵育2 h，酶标仪在450 nm处测量各孔吸光度。

2.3 细胞转染细胞传代至6孔板中，融合70%～80%时，按照转染说明书将2 μL si-FAM3C（20 μmol/L）或2 μL si-NC（20 μmol/L）与2 μL jetPRIME transfection reagent加 入 到200 μL jetPRIME buffer中，充分混合15 min后，加入到各孔中，加入2 mL有血清培养液继续培养，转染48 h后，Western blot检测转染效率，收集细胞进行后续实验。si-FAM3C的序列 为5′-CTACAAAGCCTCCCAGATA-3′，si-NC的 序列为5′-GGCUCUAGAAAAGCCUAUGC-3′。

2.4 慢病毒转染将状态良好的对数期VSMCs种于6孔板中，次日将LV-GFP组和LV-FAM3C组细胞根据赛业公司提供的说明书按感染复数（multiplicity of infection，MOI）=50进行慢病毒感染实验。转染10 h后，更换新鲜培养液，培养48 h后在荧光显微镜下拍照验证，收集细胞进行后续的实验。

2.5 Transwell实验将3×105细胞用无血清培养液悬浮，取200 μL加入到上室，700 μL含20%胎牛血清的培养液加入下室，并在37℃培养箱中孵育24 h，次日用甲醛固定15 min，结晶紫染色，棉签擦拭上室残留细胞，显微镜下拍照并计数。

2.6 免疫荧光染色将细胞种于24孔板中盖玻片上。经处理后，4%多聚甲醛固定细胞15 min，PBS洗涤3次，0.3%Triton X-100破膜10 min，正常山羊血清封闭1 h，加入vimentin和α-SMA抗体（1∶150稀释），4℃过夜孵育。次日用荧光标记的山羊抗兔及抗鼠IgG（1∶200稀释）孵育1 h，经4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染核后，抗荧光淬灭剂封片，避光条件下荧光显微镜获取图像。

2.7 Western blot实验细胞处理后，用含磷酸酶及蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液在冰上提取蛋白，BCA蛋白检测试剂测定蛋白浓度。加入上样缓冲液并加热变性，SDS-PAGE分离蛋白，转移到聚二氟乙烯膜。5%脱脂奶粉室温下封闭2 h，OPN、vimentin、β-actin、PCNA、α-SMA、FAM3C、Akt及p-Akt抗体（1∶1 000稀释）4℃孵育过夜。次日用TBST洗涤3次，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（1∶10 000稀释）和山羊抗鼠IgG（1∶5 000稀释）室温孵育2 h，TBST洗涤3次。ECL发光液显影，ImageJ软件分析图像。

3 统计学处理

所有统计分析及制图均使用GraphPad Prism 8进行。数据以均数±标准差（mean±SD）表示。采用单因素方差分析检验多组间差异，后用Turkey法进行两两比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 TGF-β1对VSMCs中FAM3C表达的影响

TGF-β1在作用24 h时随着浓度（0、1、2、5和10 μg/L）增加上调VSMCs中FAM3C的表达，TGF-β1（10 μg/L）随作用时间（0、6、12、24及48 h）增加上调FAM3C表达，以10 μg/L及24 h时最为显著（P＜0.05），故作为后续实验条件，见图1。此结果亦提示FAM3C是TGF-β1的靶基因。

2 TGF-β1诱导VSMCs表型转换

10 μg/L TGF-β1呈时间依赖性（0、6、12和24 h）上调OPN及vimentin表达，下调α-SMA表达，0、6、12及24 h组间均有显著差异（P＜0.05），vimentin免疫荧光与Western blot结果趋势类似，见图2。

3 敲减FAM3C抑制TGF-β1诱导的VSMCs表型转换、活力增强及迁移

Figure 1.Effects of TGF-β1 on the expression of FAM3C in VSMCs.Primary human VSMCs were treated with 0，1，2，5 and 10 μg/L of TGF-β1 for 24 h（A）or 10 μg/L TGF-β1 for 0，6，12，24 and 48 h（B）.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs 0 μg/L or 0 h；#P＜0.05 vs 2 μg/L；&P＜0.05 vs 5 μg/L；△P＜0.05 vs 12 h.图1 TGF-β1对VSMCs中FAM3C表达的影响

Figure 2.TGF-β1 induced phenotypic switch of VSMCs.A：the protein expression of OPN，vimentin and α-SMA detected by Western blot；B：immunofluorescence staining for vimentin（scale bar=50 μm）.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs 0 h；#P＜0.05 vs 6 h；&P＜0.05 vs 12 h.图2 TGF-β1诱导VSMCs表型转换

与si-NC和CTL组相比，si-FAM3C组中FAM3C表达降低（P＜0.05），提示已敲减FAM3C（图3A）。与si-NC组相比，si-NC+TGF-β1组细胞活力增强（P＜0.05），OPN、vimentin和PCNA表达增加（P＜0.05），α-SMA表达降低（P＜0.05），细胞迁移数量增加（P＜0.05）；与si-NC+TGF-β1组相比，si-FAM3C+TGF-β1组中TGF-β1对VSMCs的上述作用被削弱；此外，与si-NC组相比，si-FAM3C组细胞活力减弱（P＜0.05），OPN、vimentin和PCNA表达减少（P＜0.05），α-SMA表达增加（P＜0.05），细胞迁移数量减少（P＜0.05），见图3B～D。上述结果提示敲减FAM3C抑制VSMCs表型转换、活力及迁移。

4 过表达FAM3C促进TGF-β1诱导的VSMCs表型转换、活力增强及迁移

与blank组 相比，LV-GFP和LV-FAM3C组荧 光强度增加，提示慢病毒转染成功（图4A）。与LVGFP组相比，LV-FAM3C组细胞活力增强（P＜0.05），OPN、vimentin和PCNA表达增加（P＜0.05），α-SMA表达减少（P＜0.05），细胞迁移数量增多（P＜0.05），vimentin和α-SMA免疫荧光结果与Western blot结果趋势类似；与LV-GFP+TGF-β1组相比，LV-FAM3C+TGF-β1组趋势与LV-FAM3C组类似，提示过表达FAM3C增强TGF-β1对VSMCs表型转换、活力及迁移的作用，见图4B～D及图5。

5 FAM3C通过Akt介导TGF-β1诱导的VSMCs改变

与si-NC组和LV-GFP组相比，TGF-β1提高p-Akt蛋白水平（P＜0.05）；敲减FAM3C可降低p-Akt蛋白水平及减弱TGF-β1的诱导作用（P＜0.05）；过表达FAM3C对p-Akt蛋白水平的作用与敲减FAM3C相反；而加入Akti-VIII后，p-Akt蛋白水平降低（P＜0.05），OPN和vimentin表达减少（P＜0.05），α-SMA表达增加（P＜0.05），见图6。

讨 论

正常VSMCs以收缩表型存在，有利于对抗血管张力，维持血管壁稳态。然而，在多种病理状态下，VSMCs的合成表型转化增加，导致增殖、迁移和细胞外基质合成，从而引起内膜增生，是引起动脉粥样硬化、血管再狭窄和高血压的重要原因之一［14，18-19］，许多细胞因子参与VSMCs表型转换的调节，其中TGFβ1通过激活其下游Smad2/3和PI3K/Akt等通路来发挥作用［2，16］。此外，TGF-β1还可通过促进缝隙连接蛋白（connexin）43表达而导致VSMCs的增殖活力增加［20］。在本研究中，TGF-β1呈时间依赖性调节VSMCs表型转换，并可增强细胞活力及迁移能力，与既往研究结果一致［2］，因此对TGF-β1下游靶基因的调节是干预内膜增生的关键。

FAM3C作为FAM3家族重要成员之一，较多研究涉及细胞EMT及迁移。FAM3C通过Akt及细胞外信号调节激酶通路参与TGF-β1诱导的肾小管上皮EMT，促进肾纤维化［10］，还可通过PI3K/Akt途径参与胃癌的EMT及细胞迁移过程［8］，但是否参与血管内膜增生还未见报道。本研究结果表明，在VSMCs中，TGF-β1可使FAM3C蛋白表达增加，验证了FAM3C是TGF-β1的靶基因。为进一步研究FAM3C在VSMCs表型转换中的作用，我们分别对FAM3C行敲减及过表达处理。敲减FAM3C可提高收缩表型标志物α-SMA表达，降低TGF-β1诱导的合成表型标志物OPN和vimentin表达，同时降低VSMCs活力及迁移能力，而过表达FAM3C可促进TGF-β1对VSMCs表型转换、活力及迁移的调节，因此我们证实FAM3C介导TGFβ1诱导的VSMCs表型转换、活力增强及迁移。FAM3C的作用可能与其形态变化有关，研究表明二聚体FAM3C较单聚体可使癌细胞侵袭增加［21］，但在VSMCs中是否发生形态改变还需进一步研究。此外，有研究指出FAM3C上调阴阳1（yin yang 1，YY1）表达，最终激活Akt-cyclin D1通路促进乳腺癌细胞增殖和迁移［7］；而在颈动脉血管损伤后上调YY1，可抑制VSMCs收缩型标志物的表达，从而导致内膜增生［22］。在本实验中，过表达及敲减FAM3C均可独立于TGFβ1调节VSMCs表型转换、活力及迁移，因此FAM3C可能通过调节YY1或Akt参与对VSMCs的调节。

Akt作为重要的细胞内因子，参与调控细胞增殖、分化及凋亡等细胞功能。研究表明Akt通过抑制VSMCs凋亡而导致内膜增厚［16，23］，此外，Akt通过激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）而介导摄食抑制因子（nesfatin-1）诱导的VSMCs表型转换、周期转换及增殖［24］。另有研究表明，芙蓉叶通过抑制Akt/激活蛋白1（activator protein-1，AP-1）通路，抑制肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）诱导的VSMCs迁移［25］。因此，Akt在内膜增生发生发展中发挥重要作用。在本研究中，TGF-β1使Akt活化，且Akt活化在FAM3C敲减后被阻断，提示Akt是FAM3C的下游蛋白。有研究提示，过表达FAM3C可激活热休克因子1（heat shock factor 1，HSF1）-钙调素（calmodulin，CaM）-Akt通路，并增加Akt磷酸化，从而抑制糖异生［26］，另外，血管紧张素II（angiotensin II，Ang II）通过增加Ca2+的摄入而诱导早期生长反应因子1（early growth response protein-1，Egr-1）表达，而导致内膜增生，敲减CaM抑制Ang II对VSMCs表型的改变［27］。更重要的是，作为CaM的下游激酶，钙/CaM依赖性蛋白激酶II（Ca2+/CaM-dependent protein kinase II，CaMKII）通过调控线粒体对Ca2+的摄取及VSMCs迁移，导致血管损伤后的新生内膜形成［28］。在本研究中，过表达FAM3C激活Akt，促进TGF-β1对Akt的活化，其机制可能与CaM的表达有关，而Akt抑制剂作用后阻断了FAM3C对VSMCs表型转换的作用，因此FAM3C可能通过调节Akt参与TGF-β1诱导的VSMCs表型转换。这也可解释敲减及过表达FAM3C独立调节VSMCs表型转换的作用与Akt的激活有关，所以抑制Akt对VSMCs表型转换调节起到重要作用。

Figure 3.Knockdown of FAM3C inhibited TGF-β1-induced phenotypic switch and attenuated viability and migration of VSMCs.A：verification of FAM3C knockdown by Western blot；B：the cell viability detected by CCK-8 assay；C：the expression of phenotypic markers，PCNA and FAM3C detected by Western blot；D：the cell migration detected by Transwell assay（×200）.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs CTL or si-NC group；#P＜0.05 vs si-NC+TGF-β1 group.图3敲减FAM3C抑制TGF-β1诱导的VSMCs表型转换并减弱细胞活力和迁移能力

Figure 4.Overexpression of FAM3C promoted TGF-β1-induced phenotypic switch and enhanced viability of VSMCs.A：verification of lentivirus（LV）infection（scale bar=100 μm）；B：the cell viability detected by CCK-8 assay；C：the expression of phenotypic markers，PCNA and FAM3C detected by Western blot；D：immunofluorescence staining for α-SMA and vimentin（scale bar=50 μm）.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs LV-GFP group；#P＜0.05 vs LV-GFP+TGF-β1 group.图4过表达FAM3C促进TGF-β1诱导的VSMCs表型转换并增强细胞活力

Figure 5.Overexpression of FAM3C promoted TGF-β1-induced migation of VSMCs.The cell migration was detected by Transwell assay（×200）.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs LV-GFP group；#P＜0.05 vs LV-GFP+TGF-β1 group.图5过表达FAM3C促进TGF-β1诱导的VSMCs迁移

Figure 6.FAM3C mediated TGF-β1-induced phenotypic changes in VSMCs through Akt.A：effects of TGF-β1 and/or FAM3C knockdown on Akt phosphorylation；B：effects of TGF-β1 and/or FAM3C overexpression combined with Akt inhibitor VIII（Akti-VIII）on Akt phosphorylation and phenotypic marker expression.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs LV-GFP group；#P＜0.05 vs LV-GFP+TGF-β1 group；&P＜0.05 vs LV-FAM3C group；△P＜0.05 vs LV-FAM3C+TGF-β1 group.图6 FAM3C通过Akt介导TGF-β1诱导的VSMCs表型改变

总之，本研究发现FAM3C通过激活Akt参与并介导TGF-β1诱导的VSMCs表型转换、活力增强及迁移，因此FAM3C可能是干预内膜增生的潜在靶点。