基于网络药理学探讨柴胡-黄芩治疗慢性肾功能衰竭的作用机制*

万丽莎，李建英

1.山东中医药大学，山东 济南 250014；2.山东中医药大学附属青岛市中医医院，山东 青岛 266033

慢性肾功能衰竭(chronic renal failure，CRF)的主要临床表现是水、电解质紊乱以及代谢产物和毒物潴留、酸碱平衡失调和全身各系统症状[1]，在中医学中可归为“肾劳” “癃闭”“关格”“溺毒”等范畴。全国第五批名老中医药专家学术经验继承指导老师、齐鲁伤寒流派第三代传人于俊生教授认为慢性肾衰关乎少阳病变，CRF以和解少阳之法治疗时应首选小柴胡汤[2]，小柴胡汤以柴胡为君药，黄芩为臣药，柴胡疏散退热、疏肝解郁、升举阳气，黄芩清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎[3]，二者配伍能和解少阳，运转少阳枢机，使之开合有度，邪有出路，是于俊生教授治疗CRF临床常用对药[4]。前期研究证明，以柴胡、黄芩为主药的小柴胡汤加减方柴半六合汤可缓解CRF患者的胃肠道症状，延缓CRF的进一步发展[5]。以柴胡、黄芩为主药的治疗CRF的经验方补肾排毒合剂可保护肾功能[6]，提高血白蛋白、转铁蛋白水平[7]。

网络药理学为研究中药复方作用机制提供了新技术手段，可用于发现药物靶标，推进中药新药研发，有益于中医药理论的发展和传承[8]。本文使用网络药理学研究方法探讨“和解少阳法”代表药对“柴胡-黄芩”对CRF的作用机制，以期为后续的研究提供一定的参考。

1 资料与方法

1.1 柴胡、黄芩活性成分及相关靶点的筛选基于中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)[9]检索柴胡、黄芩的化学成分，根据口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%且类药性(drug-likeness，DL)≥0.18进行初步筛选，获得柴胡、黄芩的活性成分和其对应的蛋白质靶点，将未找到蛋白质靶点的成分剔除，将蛋白质靶点录入Uniprot数据库[10]，获得其标准基因名。

1.2 CRF相关靶点筛选以“chronic renal failure”为关键词，挖掘在线人类孟德尔遗传数据库(online mendelian inheritance in man，OMIM)和GeneCards数据库[11]中CRF的相关靶点。在GeneCards数据库中，Relevance score值越大表示该靶点与疾病的联系越密切，如果靶点过多则选择Relevance score值大于中位数的靶点作为疾病的潜在靶点。将两个数据库中得到的靶点合并并删除重复值后得到CRF的相关靶点。

1.3 蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络的构建及核心靶点筛选应用Draw Venn Diagram在线工具将柴胡、黄芩活性成分相关靶点与CRF相关靶点取交集并绘制韦恩图，得到的交集靶点即为柴胡-黄芩治疗CRF的潜在靶点，在EXCEL表格中利用VLOOKUP函数映射出作用于潜在靶点的活性成分，将未映射到潜在靶点的成分剔除，将数据导入Cytoscape 3.8.0软件，构建“活性成分-潜在靶点”网络图。将潜在靶点输入STRING11.0数据库[12]进行PPI网络模型构建，物种设定为“Homo sapiens”，设置minimum required interaction score>0.9，隐藏游离节点，得到PPI网络，将结果导入Cytoscape 3.8.0进行可视化，并使用Cytohubba插件采用最大集团中心性(maximal clique centrality，MCC)、最大邻域分量(maximum neighborhood component，MNC)、度(degrees)算法挖掘核心靶点，参数为默认设置，利用 Draw Venn Diagram在线工具取三个结果的交集，交集靶点为柴胡-黄芩作用于CRF的核心靶点。

1.4 潜在靶点的基因本体(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信号通路富集分析将柴胡-黄芩治疗CRF的潜在靶点录入Metascape平台[13]，设置P<0.01，进行GO功能的生物学过程(biological process，BP)富集分析及KEGG信号通路富集分析，并采用Cytoscape 3.8.0软件构建“潜在靶点-信号通路”网络图。

2 结果

2.1 柴胡-黄芩活性成分及相关靶点基于TCMSP初步提取柴胡化学成分349种、黄芩化学成分143种，以OB≥30%且DL≥0.18为标准进行筛选后获得柴胡活性成分17种、黄芩活性成分36种，其中8种化合物未找到相关靶点，将其剔除后得到柴胡活性成分13种、黄芩活性成分32种，见表1。基于TCMSP获得柴胡活性成分作用靶点181种，黄芩活性成分作用靶点120种，将两味中药活性成分的作用靶点合并，删除重复值后共获得216个药物相关靶点。

表1 柴胡-黄芩活性成分相关信息表

2.2 CRF相关靶点从GeneCards数据库中获得慢性肾功能衰竭靶点8 596个，Relevance score最大值为112.941 818 2，最小值为0.188 800 812，中位数为3.540 131 807，筛选出Relevance score大于中位数的靶点4 298个，靶点仍较多，对筛选后的靶点进行二次筛选，Relevance score最小值为3.540 928 125，中位数为7.813 783 407，筛选出Relevance score大于中位数的靶点2 149个。从OMIM数据库中获得慢性肾功能衰竭靶点578个，将两个数据库获得的靶点合并后删除重复值，最后获得慢性肾功能衰竭相关靶点2 607个。

2.3 PPI网络与核心靶点将216个活性成分相关靶点与2 607个CRF相关靶点导入Draw Venn Diagram进行映射，得到137个交集靶点，即为柴胡-黄芩治疗CRF的潜在作用靶点，并绘制韦恩图。11，13-二十碳二烯酸甲酯未映射到潜在靶点，将其剔除，将数据导入Cytoscape 3.8.0软件，构建“活性成分-潜在靶点”网络图，其中粉色矩形代表潜在靶点，圆形代表活性成分，图形大小、颜色按照degree值大小形成，degree值越大，节点越大、颜色越深，说明该成分与潜在靶点越重要，分析可知槲皮素、山柰酚、汉黄芩素在柴胡-黄芩治疗CRF中发挥重要作用。将潜在靶点输入STRING11.0数据库构建PPI网络，并将结果导入Cytoscape 3.8.0进行可视化，图中节点代表潜在靶点，边代表靶点间的互作关系，degree值越大，节点越大、颜色越深。使用Cytohubba插件中的MCC、MNC、Degrees算法挖掘核心靶点，将三种算法得出的核心靶点取交集并绘制韦恩图，得出JUN、RELA、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、肿瘤蛋白p53(tumor protein p53，TP53)、丝裂原活化蛋白激酶1(mitogen activated protein kinase 1，MAPK1)和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)6个靶点为柴胡-黄芩作用于CRF的核心靶点。见图1—图7。

注：DRUG：柴胡-黄芩相关靶点；CRF：慢性肾功能衰竭相关靶点

图3 潜在靶点PPI网络图

图4 MCC算法分析结果

图5 MNC算法分析结果

图6 Degrees算法分析结果

图7 三种算法核心靶点韦恩图

2.4 GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析GO功能富集分析共得到5437个BP条目，主要包括对无机物的应答(response to inorganic substance)、对损伤的应答(response to wounding)、对脂多糖的应答(response to lipopolysaccharide)等，设置P<0.01，根据P值排序后，选取排名前20位的条目绘制条形图。KEGG信号通路富集分析筛选得到434条信号通路，主要涉及肿瘤相关通路(pathways in cancer)、IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)、TNF信号通路(TNF signaling pathway)、细胞凋亡(apoptosis)和PI3K-Akt 信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)等，设置P<0.01，根据P值排序后，选取排名前20位的条目绘制气泡图。采用 Cytoscape 3.8.0软件构建“潜在靶点-信号通路”网络图，图中黄色矩形代表靶点，粉色三角形代表通路，连线代表靶点与通路之间的关系，通过该网络图可知柴胡-黄芩可通过多条通路的协调作用发挥治疗CRF的作用。见图8—图10。

图8 GO功能富集分析-BP

图9 KEGG信号通路富集分析

图10 “潜在靶点-信号通路”网络图

3 讨论

在我国，慢性肾脏病患病率达10.8%[14]，且患病率逐年升高[15]，CRF是各种慢性肾脏病发展至后期的一种临床综合征，目前CRF的西医诊治方案为治疗原发病、控制CRF进展的危险因素和防治并发症[16]，若发展至终末期则需选择肾脏替代治疗，严重影响患者的生存质量，对家庭和社会也产生巨大的经济负担[17]。在此背景下，如何更好的防治CRF成为亟需解决的问题，而中医药不仅可以缓解CRF患者的近期症状，还能提高患者的生活质量，为CRF的诊疗提供了更多的思路[18]。

CRF本虚在脾肾，标实为痰湿瘀毒，脾肾之水液代谢，以三焦为通道，若少阳三焦枢机不利，则气滞血瘀，痰湿不化，清浊不分，浊毒不排，故临床治疗应重视和解少阳[19-20]。柴胡-黄芩为和解之法的经典药对，二者共奏通调少阳枢机之功，在临床上应用于多种系统疾病中[21]，既往研究显示其有抗炎、抗氧化、抗凋亡等药理作用[22]。

本研究得出柴胡-黄芩治疗CRF的潜在作用靶点137个，发挥重要作用的活性成分有槲皮素、山柰酚和汉黄芩素等，筛选出6个核心靶点，包括JUN、RELA、IL-6、TP53、MAPK1和TNF。已有研究表明，TNF和IL-6与肾小球损害和硬化密切相关[23]。李玲等[24]研究显示，TNF通过促进肾间质成纤维细胞增殖促使肾间质纤维化。IL-6是重要的炎症参与因子，以自分泌及旁分泌两种方式促进肾小球系膜细胞增殖，进而造成肾小球损害[25]。Zhang等[26]研究显示，CRF患者肾脏中 IL-6 表达水平显著增加，可直接诱导肾脏中纤维化基因表达和前内皮素原1mRNA表达。RELA是 NF-κB 家族的亚单位之一，可通过多种翻译后修饰包括磷酸化、乙酰化、甲基化和泛素化等调节 NF-κB 的活性和功能[27]，而NF-κB 信号通路在肾间质纤维化中起重要的作用[28]。由此推测，柴胡-黄芩主要通过缓解肾脏炎症和肾纤维化达到改善肾功能的目的。

GO功能富集分析发现，BP主要涉及对无机物的应答、对损伤的应答、对脂多糖的应答等生物学过程。KEGG富集分析发现，与炎症相关的通路 IL-17 信号通路、TNF信号通路、PI3K-Akt 信号通路等参与了柴胡-黄芩对CRF的治疗作用。已有研究表明，TNF可促进血管紧张素Ⅱ的生成，从而导致细胞外基质的过度沉积，最终促进肾纤维化[29]。P13K-Akt 信号通路可通过介导足细胞凋亡调节细胞增殖、生长和代谢等，另外PI3K 可和下游分子 Akt 结合，导致炎症反应的发生，加快肾纤维化进程[30]。

综上所述，柴胡-黄芩中一种成分可以调控不同的作用靶点，同一靶点可以干预不同的信号通路，体现了柴胡-黄芩多成分、多靶点、多通路联合作用的特点，且柴胡-黄芩主要通过调控炎症相关靶点和通路发挥抗炎、抗纤维化作用从而改善肾功能。其中一些靶点和通路已在前期研究中得到验证，为临床运用“柴胡-黄芩”药对治疗CRF提供了科学依据。不足的是本研究未将柴胡-黄芩煎煮后的化学成分和其活性成分在体内的代谢物纳入研究，之后将在此基础上进一步实验和临床研究以阐明柴胡-黄芩治疗慢性肾功能衰竭的具体机制。