下调miR-106a-5p对过氧化氢诱导的心肌细胞损伤及JAK1/STAT3通路的影响

姜花，沈延梅，马驯凯

近年来，心血管系统疾病的发病率和致死率呈逐年上升趋势［1］。心肌细胞是一种高度分化的细胞，其过度凋亡会导致心脏功能减退，最终导致心血管疾病发生。研究表明，氧化应激反应导致的氧自由基增多可诱导心肌细胞凋亡，在缺血性心脏病、冠心病、心肌梗死等心血管疾病的发生发展过程中发挥重要作用［2-4］。因此，降低氧化应激反应水平、减少心肌细胞凋亡对治疗心血管疾病具有重要意义。微小RNA（miRNA）是一种在机体内广泛存在的非编码内源性小分子RNA，参与细胞增殖、凋亡等多种生物学行为，与包括心血管疾病在内的多种疾病的进展密切相关［5］。有研究表明，miR-106a-5p在慢性心力衰竭患者血浆中显著上调［6］，但其在心血管疾病氧化应激损伤中的作用鲜有研究。Janus激酶（Janus kinase，JAK）/信号转导和转录激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）通路是细胞因子信号传导的重要途径，参与调控细胞增殖、凋亡等多种细胞功能及氧化应激、炎症、肿瘤等多种病理过程，近年来其在心血管疾病中的作用备受重视［7-8］。研究发现，抑制JAK1/STAT3通路可改善心肌梗死大鼠心肌受损情况，从而保护心功能［9］。本研究旨在观察下调miR-106a-5p对过氧化氢（H2O2）诱导的心肌细胞损伤及JAK1/STAT3通路的影响，以期为治疗氧化应激引起的心血管疾病提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 大鼠心肌H9c2细胞（货号：HZR007）购自美国ATCC；DMEM高糖培养基、逆转录试剂盒、CCK-8试剂、Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）检测试剂盒（货号：ZY-97076、ZY1011R、ZY2701M、ZYS0185、ZY-4712-1）购自上海泽叶生物科技有限公司；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、丙二醛（malonydialdehyed，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）检测试剂盒（货号：xy-E12190、xy-E12430、xy-E12431）购自上海信裕生物科技有限公司；LipofectamineTM2000转染试剂（货号：11668-019）购自美国Invitrogen；miR-106a-5p NC、miR-106a-5p siRNA及U6、miR-106a-5p引物购自上海碧云天生物技术有限公司；SYBR Green qRT-PCR Kit（货号：CD-13505-ML）购自武汉纯度生物科技有限公司；兔源一抗p-JAK1、JAK1、p-STAT3、STAT3、GAPDH及羊抗兔二抗（货号：db2764、db9826、db2536、db1650、db7662、db10002）购自杭州戴格生物技术有限公司。NAPCO-8800型培养箱购自美国Shellab公司；Lightcycler 480Ⅱ型荧光定量PCR仪购自德国Roche公司；Stat Fax-2100型酶标仪购自美国Awareness公司；GS-800型凝胶扫描成像系统购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 使用DMEM高糖培养基（含10%胎牛血清、1%青-链霉素溶液）培养冻存复苏后H9c2细胞，在37℃、5%CO2培养箱中贴壁培养，当细胞长至85%~90%时，用0.25%胰蛋白酶消化至细胞变圆，更换新鲜培养基，按比例1∶3进行传代培养。

1.2.2 细胞分组 将传代2次后的对数生长期H9c2细胞用培养基调整为1×104个/mL的单细胞悬液，接种至96孔或12孔细胞培养板，将细胞分为对照组和H2O2处理组（50、100、200、400μmol/L），检测细胞增殖；另将细胞分为对照组、H2O2组（100μmol/L H2O2）、miR-106a-5p NC组（100μmol/L H2O2+转染4μg miR-106a-5p NC）和miR-106a-5p siRNA组（100μmol/L H2O2+转染4μg miR-106a-5p siRNA），检测细胞增殖、凋亡及miR-106a-5p、氧化应激相关因子、JAK1/STAT3通路相关蛋白表达。

1.2.3 实时荧光定量PCR（qPCR）法检测miR-106a-5p表达 细胞给予相应处理后培养48 h，使用TRIzol法提取细胞中总RNA，测定RNA样品浓度、纯度合格后分装，-80℃保存。取RNA样品，使用逆转录试剂盒合成cDNA。取cDNA样本，使用试剂盒配制qPCR反应体系，在荧光定量PCR仪上进行扩增。20μL反应体系：SYBR premix 11μL，PCR上、下游引物各0.5μL，cDNA模板1μL，ddH2O 7μL。反应条件：95℃5 min；95℃12 s，57℃30 s，40个循环。以U6为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算miR-106a-5p相对表达水平。miR-106a-5p上游引物5′-ATCCAGTGCTGTCGTG-3′，下游引物5′-TGCTAAAAGTGCTTACAGTG-3′；U6上游引物5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′，下 游 引 物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。

1.2.4 CCK-8法检测细胞增殖 细胞给予相应处理后培养48 h，更换新培养基，每孔加入CCK-8试剂10μL，放回培养箱中继续培养2 h，使用酶标仪于波长450 nm处检测光密度（OD）值，计算细胞增殖抑制率。增殖抑制率=（OD对照组-OD实验组）/OD对照组×100%。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 细胞给予相应处理后培养48 h，弃培养基，加入结合缓冲液重悬为1×106个/mL，每孔添加Annexin V-FITC试剂5μL、PI试剂5μL混匀，避光孵育1 h，使用流式细胞仪进行细胞凋亡检测。

1.2.6 试剂盒检测氧化应激相关因子表达 细胞给予相应处理后培养48 h，分离细胞培养液及细胞。使用试剂盒检测细胞培养液中LDH含量及GSH-Px活性。向细胞中加入RIPA裂解液裂解30 min，12 000 r/min离心10 min，收集细胞上清液，BCA法测定总蛋白含量，使用试剂盒测定MDA含量及SOD活性。

1.2.7 蛋白免疫印迹（Western blot）法检测细胞中JAK1/STAT3通路相关蛋白表达 细胞给予相应处理后培养48 h，弃培养基，加入RIPA裂解液裂解30 min，12 000 r/min离心10 min，收集细胞上清液，BCA法测定总蛋白含量。取60μg蛋白样品95℃处理变性，上样至10%SDS-PAGE分离胶进行电泳分离、转膜，用5%脱脂奶粉封闭2 h，洗膜后加1∶1 000稀释的一抗（兔抗p-JAK1、JAK1、p-STAT3、STAT3、GAPDH）孵育过夜，再次洗膜，加1∶2 000稀释的羊抗兔二抗室温孵育2 h再次洗膜，ECL试剂显色，凝胶扫描成像系统拍照，以GAPDH蛋白为内参蛋白分析目的蛋白条带相对灰度。

1.3 统计学方法 所有数据均采用SPSS 19.0软件分析。计量数据用均数±标准差（）表示，多组间比较使用单因素方差分析，组间多重比较使用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度H2O2对H9c2细胞增殖的影响 对照组以及50、100、200、400μmol/L H2O2处理组H9c2细胞增殖抑制率（%）分别为0.00±0.00、17.56±1.22、33.28±1.54、48.08±2.86、62.83±3.72。与 对 照 组 相比，各个浓度H2O2处理组H9c2细胞增殖抑制率均显著升高（P＜0.05）。其中，100μmol/L H2O2接近30%细胞生长抑制浓度（30% growth inhibitory concentration，IC30），选择该浓度用于后续实验。

2.2 各组H9c2细胞中miR-106a-5p表达水平、增殖抑制率及凋亡情况 与对照组相比，H2O2组H9c2细胞miR-106a-5p表达水平、增殖抑制率及凋亡率显著升高（P＜0.05）；H2O2组与miR-106a-5p NC组H9c2细胞中miR-106a-5p表达水平、增殖抑制率及凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05）；与miR-106a-5p NC组相比，miR-106a-5p siRNA组H9c2细胞miR-106a-5p表达水平、增殖抑制率及凋亡率显著降低（P＜0.05），见表1、图1。

Tab.1 Comparison of miR-106a-5p expression level,proliferation inhibition rate and apoptosis rate between the four groups of H9c2 cells表1 各组H9c2细胞中miR-106a-5p表达水平、增殖抑制率及凋亡率比较 （n=6）

Tab.1 Comparison of miR-106a-5p expression level,proliferation inhibition rate and apoptosis rate between the four groups of H9c2 cells表1 各组H9c2细胞中miR-106a-5p表达水平、增殖抑制率及凋亡率比较 （n=6）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与H2O2组比较，c与miR-106a-5p NC组比较，P＜0.05。

组别对照组H2O2组miR-106a-5p NC组miR-106a-5p siRNA组F miR-106a-5p 1.00±0.00 1.64±0.12a 1.66±0.12a 0.85±0.10bc 110.737＊＊增殖抑制率（%）0.00±0.00 32.95±1.58a 33.54±1.43a 14.30±1.05abc 1 110.412＊＊凋亡率（%）5.62±0.52 35.08±1.63a 34.55±1.56a 17.26±1.04abc 762.780＊＊

2.3 各组H9c2细胞培养液LDH含量、GSH-Px活性及细胞中MDA含量、SOD活性情况 与对照组相比，H2O2组H9c2细胞培养液LDH含量及细胞中MDA含量显著升高（P＜0.05），细胞培养液GSH-Px活性及细胞中SOD活性显著降低（P＜0.05）；H2O2组与miR-106a-5p NC组H9c2细胞培养液LDH含量、GSH-Px活性及细胞中MDA含量、SOD活性差异无统计学意义（P＞0.05）；与miR-106a-5p NC组相比，miR-106a-5p siRNA组H9c2细胞培养液LDH含量及细胞中MDA含量显著降低（P＜0.05），细胞培养液GSH-Px活性及细胞中SOD活性显著升高（P＜0.05），见表2。

Fig.1 Apoptosis of H9c2 cells in each group图1 各组H9c2细胞凋亡情况

Tab.2 Comparison of LDH content,GSH-Px activity,MDA content and SOD activity in H9c2 cell culture medium between the four groups表2各组H9c2细胞培养液LDH含量、GSH-Px活性及细胞中MDA含量、SOD活性比较 （n=6，x±s）

2.4 各组H9c2细胞中JAK1/STAT3通路相关蛋白表达情况 与对照组相比，H2O2组H9c2细胞中p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3显著升高（P＜0.05）；H2O2组与miR-106a-5p NC组H9c2细胞中p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT水平差异无统计学意义（P＞0.05）；与miR-106a-5p NC组相比，miR-106a-5p siRNA组H9c2细胞中p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3显著降低（P＜0.05），见图2、表3。

Fig.2 Protein expressions of p-JAK1,JAK1,p-STAT3 and STAT3 in H9c2 cells of each group图2 各组H9c2细胞中p-JAK1、JAK1、p-STAT3、STAT3蛋白表达情况

Tab.3 Comparison of protein expression levels of p-JAK1/JAK1 and p-STAT3/STAT3 between the four groups of H9c2 cells表3各组H9c2细胞中p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3蛋白表达水平比较 （n=6，）

Tab.3 Comparison of protein expression levels of p-JAK1/JAK1 and p-STAT3/STAT3 between the four groups of H9c2 cells表3各组H9c2细胞中p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3蛋白表达水平比较 （n=6，）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与H2O2组比较，c与miR-106a-5p NC组比较，P＜0.05。

组别对照组H2O2组miR-106a-5p NC组miR-106a-5p siRNA组F p-JAK1/JAK1 0.30±0.04 0.84±0.07a 0.81±0.07a 0.52±0.06abc 105.000＊＊p-STAT3/STAT3 0.34±0.05 0.89±0.08a 0.87±0.07a 0.50±0.07abc 96.086＊＊

3 讨论

心肌损伤是多种心血管疾病的病理基础，而心肌细胞凋亡是其发生的主要过程之一。研究显示，治疗心血管疾病时，心肌缺血-再灌注过程会促使心肌细胞产生大量的氧自由基，增强氧化应激反应，破坏细胞膜结构，最终诱导心肌细胞凋亡［10］。H2O2是重要的氧化反应分子，参与调控细胞增殖、基因表达，具有易穿膜、价格低廉及性质稳定等特点，一般用作体外构建氧化应激细胞模型的诱导剂［11］。大鼠H9c2心肌细胞易培养，进行实验可重复性强且批间差异小，近年来常应用于心血管领域研究［12］。本研究设置H2O2浓度梯度处理大鼠心肌细胞H9c2，最后选择最接近IC30的100μmol/L用于构建氧化应激H9c2细胞模型。MDA是过氧化产物之一，可反映细胞内脂质过氧化程度及氧化应激程度；LDH在细胞受到氧自由基攻击产生损伤时会从细胞内释放出来，可反映心肌细胞膜受损程度及氧化应激程度；GSH-Px、SOD在生理下可清除细胞内外的氧自由基，减轻细胞损伤程度，发挥抗氧化应激作用［13-15］。本研究结果显示，与对照组相比，H2O2组H9c2细胞增殖抑制率、凋亡率显著升高，细胞培养液LDH含量及细胞中MDA含量显著升高，细胞培养液GSHPx活性及细胞中SOD活性显著降低，提示H2O2可促进氧化应激反应，抑制抗氧化应激反应，抑制H9c2细胞增殖并诱导细胞凋亡。

近年来，随着对非编码RNA研究的深入，miRNAs在心血管疾病及心肌细胞凋亡中发挥的作用越来越受到关注。miR-92a、miR-29b、miR-495-3p等均已被发现与H2O2诱导的心肌细胞凋亡有关［16-18］。李璐等［6］分析慢性心力衰竭患者血浆中miRNA表达谱发现，miR-106a-5p表达水平在慢性心力衰竭患者血浆中显著上调。本研究结果显示，与对照组相比，H2O2组H9c2细胞中miR-106a-5p表达水平显著升高，提示miR-106a-5p在H2O2诱导的氧化应激损伤H9c2细胞中高表达。而下调miR-106a-5p表达后，H2O2诱导的H9c2细胞增殖抑制率、凋亡率显著降低，同时细胞培养液LDH含量及细胞中MDA含量显著降低，细胞培养液GSH-Px活性及细胞中SOD活性显著升高，提示下调miR-106a-5p可提高抗氧化应激能力，减轻氧化应激，抑制H2O2诱导的H9c2细胞凋亡，发挥抗心肌细胞氧化应激损伤的作用。

JAK/STAT通路是一种应激反应途径，将信号由细胞表面传递至细胞核，进而调节基因表达。其中，JAK1/STAT3信号通路在心血管疾病中发挥的作用至关重要。研究发现，短暂性心肌缺血/再灌注可激活JAK1，从而激活下游STAT3通路，抑制JAK/STAT通路激活可减轻心肌细胞凋亡引起的组织损伤［19］。张静等［20］研究亦显示，苦参提取物能减轻缺血再灌注大鼠心肌损伤，可能与抑制JAK/STAT信号通路成员JAK2、STAT1、STAT3激活有关。本研究结果显示，H2O2组H9c2细胞中p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3较对照组显著升高，提示H2O2可激活H9c2细胞中的JAK1/STAT3信号通路。下调miR-106a-5p表达后，H2O2诱导的H9c2细胞中p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3蛋白表达水平显著降低，提示下调miR-106a-5p表达可抑制JAK1/STAT3信号通路激活，推测H2O2激活H9c2细胞中的JAK1/STAT3信号通路可能与miR-106a-5p水平升高有关。

综上所述，下调miR-106a-5p表达可抑制JAK1/STAT3信号通路激活，调节氧化应激/抗氧化应激平衡，减轻H2O2诱导的H9c2细胞凋亡，本研究可能为防治氧化应激引起的心血管疾病提供一定参考。