雷公藤多苷对高糖诱导人肾小管上皮细胞凋亡及CXCL10/CXCR3轴的影响

李明霞，乔海霞，王晓玲，贾丽媛，胡利梅，任卫东△

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）属于糖尿病常见的微血管并发症，是引起终末期肾脏病的主要原因，与代谢紊乱、氧化应激、免疫异常、遗传等多种因素有关［1］。高糖环境引起的氧化损伤和肾小管上皮细胞的异常凋亡是DN发展的重要因素［2］。CXC趋化因子配体10（CXC chemokine ligand 10，CXCL10），是一种由多种细胞分泌的促炎性趋化因子，主要与其配体CXC趋化因子受体3（CXC chemokine receptor 3，CXCR3）结合发挥生物学功能，参与糖尿病等多种自身免疫性疾病的发生［3-4］。雷公藤多苷（tripterygium glycosides，TG）是从雷公藤根茎中提取的一种脂溶性混合物，可抑制趋化因子、炎性介质的产生与释放，临床上TG可用于治疗类风湿性关节炎、原发性肾小球肾病、肾病综合征、银屑病等多种免疫性疾病［5-6］。研究表明TG能够降低DN患者尿蛋白，减轻足细胞损伤，保护肾功能［7］。目前，有关TG在DN中的作用机制尚不清楚。本研究通过体外高糖诱导肾小管上皮细胞，并进行不同剂量的TG处理，探讨TG对高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡及CXCL10/CXCR3轴的影响。

1 材料与方法

1.1 材料（1）细胞。人肾小管上皮细胞HK-2（批号SCSP-511）购自上海素尔生物科技有限公司。（2）药品与试剂。雷公藤多苷片（规格10 mg，批号20210611）购自浙江得恩德制药有限公司；DMEM培养基（批号SH30021.01）、胎牛血清（批号SH30072.03）购自美国Hyclone公司；青霉素-链霉素（批号15070063）、胰蛋白酶（批号15050057）购自美国Gibco公司；四甲基偶氮唑盐比色（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法微量酶反应试剂盒（批号C0009）、Annexin V-Alexa Fluor 488/PI细胞凋亡检测试剂盒（批号CA1040）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测试剂盒（批号CA1410）、蛋白提取试剂盒（批号P0025）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）检测试剂盒（批号S0103）购自上海碧云天生物技术公司；肿瘤 坏 死 因 子（tumor necrosis factor，TNF）-α（批 号SEA133Hu）、转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β1（批号SEA124Hu）酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒购自武汉云克隆科技股份有限公司；兔源胱天蛋白酶（Caspase）-3（批号ab184787）、Caspase-9（批号ab32539）、CXCL10（批号ab14969）、CXCR3（批号ab133420）、GAPDH（批号ab234437）一抗、羊抗兔二抗（ab205718）购自英国Abcam公司。（3）仪器。CP-ST100A型CO2培养箱、SpectraMaxiD5型酶标仪购自长沙长锦科技有限公司；Accuri C6型流式细胞仪购自北京科誉兴业科技发展有限公司；FCK-40C型荧光显微镜购自上海光学仪器厂；WD-9413C型凝胶成像系统购自北京精信达生物科技有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞培养 将HK-2细胞复苏，接种至含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM培养基中，于37℃、5%CO2培养箱中培养，细胞融合度达到80%左右时进行传代。

1.2.2 细胞分组与处理 以少量DMEM培养基将TG充分溶解，0.45μm滤膜过滤，用DMEM培养基将TG稀释至12.5、25、50 mg/L［8］。收集1.2.1中传至第3代的HK-2细胞，弃原培养基，更换为含5.5 mmol/L葡萄糖的无血清DMEM培养基。培养24 h后，将细胞分为对照组（含5.5 mmol/L葡萄糖培养基）、高糖组（含25 mmol/L葡萄糖培养基）［9］及12.5、25、50 mg/L TG组（分别用12.5、25、50 mg/L的TG和25 mmol/L葡萄糖培养基）［8］。37℃、5%CO2培养箱中继续培养48 h。每组重复6次。

1.2.3 MTT法检测HK-2细胞活性 收集1.2.2中各组HK-2细胞，调整细胞数目为1×106个/孔加至96孔板中，每孔加入20μL MTT溶液，继续培养4 h，每孔加入100μL二甲基亚砜，充分振荡，酶标仪检测各孔570 nm波长处光密度（OD）值，计算细胞活力（%）=（实验组OD值/对照组OD值）×100%。

1.2.4 流式细胞仪检测HK-2细胞凋亡 收集1.2.2中各组HK-2细胞，以不含乙二胺四乙酸的胰蛋白酶消化，1 000 r/min离心10 min，弃原培养液，磷酸盐缓冲液（PBS）重悬细胞，1 000 r/min离心10 min，吸除上清液；用稀释好的缓冲液重悬细胞，调整细胞浓度为1×106个/mL，吸取100μL细胞悬液至流式管中，加入5μL Annexin V-Alexa Fluor 488，混匀，遮光孵育5 min，加入10μL碘化丙锭（PI）溶液，混匀，流式细胞仪观察细胞凋亡。

1.2.5 2’，7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）法检测HK-2细胞ROS水平 收集1.2.2中各组HK-2细胞，调整细胞数目为1×105个/mL，按照ROS检测试剂盒说明书，弃去细胞原培养基，更换浓度为5μmol/L的DCFH-DA稀释液，37℃孵育30 min。PBS洗涤细胞3次，流式细胞仪495 nm激发波长和515 nm发射波长评估ROS荧光强度，荧光显微镜观察细胞内ROS荧光图像。

1.2.6 黄嘌呤氧化酶法检测HK-2细胞SOD水平 收集

1.2.2 中各组HK-2细胞，4℃、1 500 r/min离心10 min，弃上清液，超声匀浆，SOD试剂盒检测细胞中SOD水平。

1.2.7 ELISA检测HK-2细胞中炎性因子TNF-α、TGF-β1水平 收集1.2.2中各组HK-2细胞，1 000 r/min离心10 min，收集细胞上清液，ELISA试剂盒检测各组细胞中炎性因子TNFα、TGF-β1水平。

1.2.8 蛋白免疫印迹法检测HK-2细胞中凋亡蛋白（Caspase-3、Caspase-9）和CXCL10/CXCR3轴蛋白表达 收集1.2.2中各组HK-2细胞，调整细胞数目为1×105个/孔加至24孔板中，蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，定量蛋白浓度后，上样蛋白样品进行电泳，转膜，封闭，分别加入Caspase-3（1∶800）、Caspase-9（1∶800）、CXCL10（1∶800）、CXCR3（1∶800）、GAPDH（1∶1 000）一抗稀释液，4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入二抗稀释液（1∶2 000），室温孵育1 h，TBST洗膜3次，蛋白凝胶成像系统成像，Image Pro Plus 6.0图像软件分析蛋白条带灰度值，以目的蛋白与内参蛋白灰度值比值作为蛋白相对表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 25.0进行数据分析，计量资料采用均数±标准差（）描述，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较行SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组HK-2细胞活力比较 与对照组比较，高糖组HK-2细胞活力降低（P＜0.05）；与高糖组比较，12.5、25、50 mg/L TG组HK-2细胞活力升高，且随着TG剂量的升高，HK-2细胞活力逐渐升高（P＜0.05），见表1。

Tab.1 Comparison of HK-2 cell viability and apoptosis rate between the five groups表1 各组HK-2细胞活力、凋亡率比较（n=6，%）

Tab.1 Comparison of HK-2 cell viability and apoptosis rate between the five groups表1 各组HK-2细胞活力、凋亡率比较（n=6，%）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与高糖组比较，c与12.5 mg/L TG组比较，d与25 mg/L TG组比较，P＜0.05。

组别对照组高糖组12.5 mg/L TG组25 mg/L TG组50 mg/L TG组F细胞活力100.00±0.00 62.75±3.46a 76.42±3.21b 85.14±3.89bc 93.22±4.16bcd 116.531＊＊细胞凋亡率8.34±1.84 36.75±2.73a 29.63±2.19b 21.56±1.95bc 11.42±1.54bcd 197.208＊＊

2.2 各组HK-2细胞凋亡率比较 与对照组比较，高糖组HK-2细胞凋亡率升高（P＜0.05）；与高糖组比较，12.5、25、50 mg/L TG组HK-2细胞凋亡率降低，且随着TG剂量的升高，HK-2细胞凋亡率逐渐降低（P＜0.05），见表1、图1。

2.3 各组HK-2细胞ROS、SOD水平比较 与对照组比较，高糖组HK-2细胞ROS水平升高，SOD水平降低（P＜0.05）；与高糖组比较，12.5、25、50 mg/L TG组HK-2细胞ROS水平降低，SOD水平升高，且随着TG剂量的升高，HK-2细胞ROS水平逐渐降低，SOD水平逐渐升高（P＜0.05），见表2、图2。

Tab.2 Comparison of ROS and SOD levels of HK-2 cells between the five groups表2各组HK-2细胞ROS、SOD水平比较（n=6）

Tab.2 Comparison of ROS and SOD levels of HK-2 cells between the five groups表2各组HK-2细胞ROS、SOD水平比较（n=6）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与高糖组比较，c与12.5 mg/L TG组比较，d与25 mg/L TG组比较，P＜0.05。

组别对照组高糖组12.5 mg/L TG组25 mg/L TG组50 mg/L TG组F ROS（荧光强度）100.49±8.17 254.39±14.54a 207.58±13.47b 162.71±10.32bc 112.88±9.47bcd 190.452＊＊SOD（U/mL）16.72±1.96 7.41±0.77a 9.12±0.98b 11.36±1.25bc 14.58±1.47bcd 48.180＊＊

2.4 各组HK-2细胞炎性因子TNF-α、TGF-β1水平比较 与对照组比较，高糖组HK-2细胞TNF-α、TGF-β1水平升高（P＜0.05）；与高糖组比较，12.5、25、50 mg/L TG组HK-2细胞TNF-α、TGF-β1水平降低，且随着TG剂量的升高，HK-2细胞TNF-α、TGF-β1水平逐渐降低（P＜0.05），见表3。

2.5 各组HK-2细胞凋亡蛋白、CXCL10、CXCR3蛋白表达比较 与对照组比较，高糖组HK-2细胞Caspase-3、Caspase-9、CXCL10、CXCR3蛋白表达升高（P＜0.05）；与高糖组比较，12.5、25、50 mg/L TG组HK-2细胞Caspase-3、Caspase-9、CXCL10、CXCR3蛋白表达降低，且随着TG剂量的升高，HK-2细胞4种蛋白表达逐渐降低（P＜0.05），见表4、图3。

Fig.1 The apoptosis of HK-2 cells in each group detected by flow cytometry图1 流式细胞术检测各组HK-2细胞凋亡

Fig.2 ROS fluorescence image of HK-2 cells observed by fluorescence microscope(×200)图2 荧光显微镜观察HK-2细胞ROS荧光图像（×200）

Tab.3 Comparison of inflammatory factors TNF-αand TGF-β1 levels of HK-2 cells between five groups表3 各组HK-2细胞炎症因子TNF-α、TGF-β1水平比较（n=6，ng/L，）

Tab.3 Comparison of inflammatory factors TNF-αand TGF-β1 levels of HK-2 cells between five groups表3 各组HK-2细胞炎症因子TNF-α、TGF-β1水平比较（n=6，ng/L，）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与高糖组比较，c与12.5 mg/L TG组比较，d与25 mg/L TG组比较，P＜0.05。

组别对照组高糖组12.5 mg/L TG组25 mg/L TG组50 mg/L TG组F TNF-α 21.44±3.56 68.79±7.11a 55.36±6.68b 35.42±4.45bc 24.91±3.13bcd 90.086＊＊TGF-β1 25.39±4.37 77.92±7.81a 61.43±5.76b 45.72±5.11bc 31.24±4.69bcd 87.014＊＊

Tab.4 Comparison of protein expressions of Caspase-3,Caspase-9,CXCL10 and CXCR3 in HK-2 cells between the five groups表4 各组HK-2细胞Caspase-3、Caspase-9、CXCL10、CXCR3蛋白表达比较 （n=6）

Tab.4 Comparison of protein expressions of Caspase-3,Caspase-9,CXCL10 and CXCR3 in HK-2 cells between the five groups表4 各组HK-2细胞Caspase-3、Caspase-9、CXCL10、CXCR3蛋白表达比较 （n=6）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与高糖组比较，c与12.5 mg/L TG组比较，d与25 mg/L TG组比较，P＜0.05。

CXCR3 0.19±0.03 0.83±0.11a 0.62±0.09b 0.41±0.07bc 0.24±0.04bcd 77.794＊＊组别对照组高糖组12.5 mg/L TG组25 mg/L TG组50 mg/L TG组F Caspase-3 0.21±0.03 0.73±0.09a 0.58±0.07b 0.39±0.04bc 0.28±0.03bcd 84.457＊＊Caspase-9 0.31±0.04 0.84±0.10a 0.72±0.08b 0.56±0.06bc 0.41±0.05bcd 58.718＊＊CXCL10 0.26±0.03 0.77±0.08a 0.61±0.07b 0.49±0.04bc 0.31±0.03bcd 90.857＊＊

Fig.3 Western blot assay of Caspase-3,Caspase-9,CXCL10 and CXCR3 of HK-2 cells in each group图3 各组HK-2细胞Caspase-3、Caspase-9、CXCL10、CXCR3蛋白印迹图

3 讨论

DN早期主要表现为尿蛋白增多、肾小球病变，弥漫性和结节性系膜扩张和肾小球基底膜增厚是DN患者最显著的病理改变［10］。肾小管上皮细胞是肾小管间质的主要细胞，能够过滤对肾小球有用的物质，肾小管上皮细胞凋亡和损伤会导致肾小球滤过膜功能障碍，从而诱导慢性肾脏病的发生［11］。肾小管细胞损伤过程中涉及氧化应激、炎症和细胞凋亡等过程，高糖环境导致肾脏组织中过量ROS的产生，诱发氧化应激反应，造成线粒体功能障碍，能量代谢不足，引起肾小管细胞凋亡和损伤［12］。本研究结果表明，高糖诱导促进HK-2细胞的凋亡，ROS及炎性因子TNF-α、TGF-β1的产生，抑制SOD水平，与Xie等［13］研究结果相似，提示DN发生与氧化应激、肾小管上皮细胞凋亡以及炎症反应有关，具体机制有待进一步研究。

趋化因子由多种细胞分泌，具有炎症趋化特性，在免疫应答过程中，趋化因子能够趋化活化的T淋巴细胞、单核细胞等，通过G蛋白偶联受体进入炎症损伤区发挥促炎作用［14］。CXCL10由干扰素-γ（IFN-γ）诱导产生，又被称为干扰素-γ-可诱导蛋白10，为1型糖尿病自身免疫破坏的驱动因子。有文献报道，CXCL10的高表达可加速糖尿病发展，CXCR3是CXCL9、CXCL10、CXCL11的共同受体，分布于活化的T细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞等多种免疫细胞的表面［15］。Du等［16］研究表明，CXCR3可通过诱导线粒体功能障碍促进非酒精性脂肪性肝病的发生。Li等［17］研究发现，高糖诱导的足细胞中CXCR3表达显著上调，而沉默CXCR3能够抑制高糖诱导的足细胞凋亡以及炎性因子TNF-α和白细胞介素-6（IL-6）的释放。本研究发现，与对照组比较，高糖组CXCL10、CXCR3蛋白表达升高，提示CXCL10/CXCR3轴可能与DN发生有关。

TG是一种植物免疫抑制剂，对DN、免疫球蛋白（Ig）A肾病具有一定的疗效［6］。杨忠民等［18］研究表明，TG能够改善IgA肾病大鼠肾功能，减轻大鼠肾组织病理损伤。Wu等［19］研究表明，TG能够抑制DN大鼠肾小球巨噬细胞浸润，抑制TNF-α、TGF-β1等炎性因子的过表达，改善大鼠肾小球硬化。本研究结果表明，TG能够抑制高糖诱导的HK-12细胞的凋亡及凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9的表达，并抑制细胞内ROS、TNF-α和TGF-β1的产生，增加细胞中SOD水平，提示TG可能通过抑制肾小管上皮细胞凋亡在DN治疗中发挥作用，推测可能是TG抑制了高糖诱导的氧化应激和炎症反应，进而抑制HK-12细胞的凋亡，具体机制有待进一步研究。杜颖等［20］研究表明，TG联合异甘草酸镁治疗能够降低自身免疫性肝炎患儿血清CXCL10的水平，减轻机体炎症反应。本研究进一步发现TG组HK-2细胞CXCL10、CXCR3蛋白表达低于高糖组，提示TG尤其是高剂量TG能够抑制高糖诱导的HK-2细胞中CXCL10/CXCR3轴的活性，这可能是TG抑制HK-2细胞凋亡及治疗DN的机制。

综上所述，TG可抑制高糖诱导的HK-2细胞凋亡、氧化应激和炎症反应，其机制可能与抑制CXCL10/CXCR3轴有关，这可能是TG治疗DN的机制。然而，本研究仅从体外水平分析了TG对CXCL10/CXCR3轴和HK-2细胞的影响，下一步需结合体内实验进一步分析TG与DN发生过程中CXCL10/CXCR3轴和肾小管上皮细胞凋亡的关系。