VEGFR-3+单核细胞对高血压小鼠左心室重塑的影响

杨国红，余芳芳，蔡伟，牛秀珑，张芯，赵季红，李玉明，陈少伯△

随着人们生活水平的提高及生活方式的变化，高血压的患病率持续增高。2012—2015年中国高血压调查发现，我国成人高血压患病人数为2.45亿，患病率高达27.9%，由此造成的心血管疾病的负担也与日俱增［1］。防治高血压及相关的靶器官损伤，进而控制心血管疾病的发展，已刻不容缓。笔者前期研究发现，自发性高血压大鼠（SHR）在质量分数为8%的NaCl饮食下干预12周可引起收缩压的显著增高和心肌淋巴管的增生，而通过过表达血管内皮生长因子（VEGF）-C促使淋巴管过度增生，可使收缩压及左心室重塑得到改善［2-3］。另有报道，外周血中有一部分组成性表达血管内皮生长因子受体（VEGFR）-3的幼稚单核细胞，在特定的条件下可进入外周组织分化为淋巴管内皮细胞，促进淋巴管的生成［4-6］。可否通过调节VEGFR-3+单核细胞来改善高血压及左心室重塑，目前尚少见相关报道。本研究利用流式细胞仪分选VEGFR-3+单核细胞，对高血压小鼠进行干预，观察VEGFR-3+单核细胞对高盐诱导的高血压及左心室重塑的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级6周龄雄性C57BL/6小鼠100只［动物生产许可证号：SCXK（京）2014-0013］及不同质量分数NaCl饲料均购自天津市奥臣实验动物销售有限公司；山羊抗小鼠VEGFR-3-Flt-4抗体购自R&D Systems公司；大鼠抗小鼠Ly6G-PerCP/Cy5.5、大鼠抗小鼠CD11b-PE抗体、大鼠抗小鼠F4/80-PE-Cy5抗体均购自Biolegend公司；TRIzol购自TAKARA公司；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit、SYBR Green实时定量PCR试剂购自Roche公司，所用引物购自北京六合华大基因科技有限公司；N-硝基-L-精氨酸甲酯（Nω-Nitro-L-arginine Methyl Ester，L-NAME）、麦胚凝集素（wheat germ agglutinin，WGA）均购自Sigma公司；4’，6-diamidino-2-phenylindole，dihydrochloride（DAPI）购自Roche公司；Masson染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；小鼠尾压CODATM监测系统购自美国Kent Scientific公司；荧光定量PCR（qPCR）仪（ABI 7300）购自美国Applied Biosystems公司；FC 500流式细胞仪购自美国Beckman Coulter公司；FACSAria流式细胞分选系统购自美国BD公司；Vevo 2100超声影像系统购自加拿大Visual Sonic公司；E600POL偏振光显微镜和ECLIPSE 80i荧光显微镜均购自日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组与喂养方法 C57BL/6小鼠经适应性喂养1周后，以随机数字表法分为正常盐（0.5%NaCl）饮食组（NS组，n=10）、高盐（8%NaCl）饮食组（HS组，n=10），HS+LNAME组（HS+L组，n=50）及HS+L-NAME+外周血VEGFR-3+单核细胞（PBVM）干预组（HS+L+PBVM组，n=30）。所有实验小鼠均饲养于清洁级实验室，饲养条件：室温20~24℃，相对湿度55%~65%，氨浓度＜20 mg/L，自由饮水，给光7：00—19：00。分别在干预前、8周、12周利用小鼠尾压监测系统动态测量小鼠收缩压。

1.2.2 PBVM的制备与干预 在高盐饮食干预9~12周时利用FACSAria流式细胞分选系统采集HS+L组小鼠PBVM，具体方法如下：经下颌下静脉采集C57BL/6小鼠外周血1 mL加入EDTA抗凝的EP管中混匀。依次加入抗小鼠Ly6GPerCP-Cy5.5、CD11b-PE及VEGFR-3-Flt-4抗体与抗凝血混匀并避光孵育15 min，之后加入10 mL红细胞裂解液避光孵育10 min，350×g离心5 min弃上清液后加入1 mL细胞染色缓冲液重悬细胞，再次以350×g离心5 min，随后以1.5 mL细胞染色缓冲液重悬细胞，上机分选。分选所得PBVM经尾静脉注射对HS+L+PBVM组小鼠进行干预，从高盐饮食干预第9周开始，每周干预1次，每次5×105个PBVM，共4次。

1.2.3 小鼠心肌组织PBVM的鉴定 于PBVM注射后第1周的第1、2、3、5、7天分别处死部分HS+L+PBVM及HS+L组小鼠（每组每次4只）取心肌组织制备单个核细胞悬液，利用流式细胞术对单个核细胞悬液中VEGFR-3+巨噬细胞进行鉴定。小鼠心肌剪碎后，冷PBS清洗3次，将含组织块的PBS悬液置于Medmachine（Dako，Denmark）中制备单个核细胞。随后用300目滤器过滤，250×g离心5 min，沉淀物以PBS重悬。制备的单个核细胞中依次加入抗小鼠F4/80-PE-Cy5及VEGFR-3-Flt-4抗体，混匀并避光孵育15 min，弃上清后加入500μL细胞染色缓冲液重悬细胞，上机检测，设门方法见图1。应用Flow Jo 7.6.1软件对流式数据进行分析［7］。

1.2.4 qPCR 12周高盐饮食干预结束后处死各组小鼠，取左心室心肌组织，以TRIzol法提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA后，以qPCR检测心肌组织张力应答增强子结合蛋白（TonEBP）以及淋巴管内皮细胞标志物同源盒转录因子（Prox）-1、淋巴管透明质酸受体（LYVE）-1、足蛋白（Podoplanin）、VEGF-C mRNA表达水平。PCR反应体系20μL：cDNA模板1μL，上、下游引物各0.5μL，2×SYBR Green Master 10μL，MilliQ超纯水8μL。PCR反应条件：50℃2 min；95℃10 min；95℃15 s，60℃1 min，30个循环。采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达水平：ΔΔCt=实验组（Ct目的基因-Ct内参基因）-对照组（Ct目的基因-Ct内参基因）。所用引物序列见表1。

Fig.1 The gating method for flow cytometry analysis of F4/80+/VEGFR-3+macrophages图1 F4/80+/VEGFR-3+巨噬细胞流式细胞术分析的设门方法

Tab.1 The primer sequence of qPCR表1 qPCR引物序列

1.2.5 小鼠心脏超声参数测定 在高盐干预12周末进行小鼠心脏超声参数的测定。在麻醉状态（2.5%异氟烷）下进行超声数据的采集，测定的参数包括：左心室舒张末期内径（LVEDD）、左心室收缩末期内径（LVESD）、左心室舒张末期容积（LVEDV）、左心室收缩末期容积（LVESV）和左心室后壁厚度（LVPWT），计算左心室缩短分数（LVFS）和左心室射血分 数（LVEF），LVFS=（LVEDD-LVESD）/LVEDD，LVEF=（LVEDV-LVESV）/LVEDV［7］。

1.2.6 小鼠心肌组织病理学分析 取小鼠左心室横截面心肌组织，经石蜡包埋后，制备5μm厚的切片进行病理染色分析。Masson染色后的切片在显微镜下获取图像，利用Image Pro Plus 5.0软件计算胶原容积分数（CVF）；WGA染色后的切片在荧光显微镜下获取图像，利用Image Pro Plus 5.0分析软件计算心肌细胞横截面积（CSA），每张切片选取10个视野，所得平均值进行统计分析。

1.3 统计学方法 应用SPSS 18.0软件进行数据分析，连续型变量以表示，2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠收缩压比较 高盐干预12周时，HS组、HS+L组及HS+L+PBVM组收缩压水平高于NS组，而HS+L+PBVM组收缩压水平较HS+L组显著减低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

Tab.2 The comparison of systolic blood pressure of mice between different groups表2 各组小鼠收缩压的比较（n=8，mmHg，

Tab.2 The comparison of systolic blood pressure of mice between different groups表2 各组小鼠收缩压的比较（n=8，mmHg，

＊＊P＜0.01；a与NS组比较，b与HS组比较，c与HS+L组比较，P＜0.05。1 mmHg=0.133 kPa。

组别NS组HS组HS+L组HS+L+PBVM组F基线113.13±4.82 114.25±4.17 112.25±4.23 113.63±3.11 0.335 8周115.13±5.69 134.63±4.57a 137.13±6.24a 138.00±13.71a 13.380＊＊12周113.25±4.33 136.63±13.05a 152.88±19.36ab 138.50±7.07ac 12.850＊＊

2.2 小鼠心肌组织中F4/80+/VEGFR-3+巨噬细胞的分析结果 小鼠心肌组织中VEGFR-3+巨噬细胞流式细胞术分析结果显示，注射PBVM后，HS+L+PBVM组的F4/80+/VEGFR-3+巨噬细胞比例显著高于HS+L组；HS+L+PBVM组F4/80+VEGFR-3+细胞在第3天达峰值，随后逐渐减低，见表3。

2.3 各组小鼠淋巴管内皮细胞相关标志物及TonEBP的mRNA表达水平的比较 HS组、HS+L组及HS+L+PBVM组TonEBP、VEGF-C、Prox-1、Podoplanin及LYVE-1的mRNA表达水平高于NS组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；同时，HS+L+PBVM组VEGF-C、Prox-1、Podoplanin及LYVE-1的mRNA表达水平高于HS+L组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表4。

2.4 各组小鼠心脏超声结果比较 与NS组比较，HS组、HS+L组及HS+L+PBVM组LVEDD显著增加，LVEF及LVFS显著减低，差异均有统计学意义（P＜0.05），出现不同程度的左心室肥厚及心脏收缩功能减低。HS+L+PBVM组LVEDD、LVPWT低于HS+L组，LVFS、LVEF高于HS+L组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图2、表5。

Tab.3 The comparison of the ratio of F4/80+/VEGFR-3+macrophages in myocardial tissue of mice between the two groups表3 2组小鼠心肌组织中F4/80+/VEGFR-3+巨噬细胞比例的比较 （n=4，%）

Tab.3 The comparison of the ratio of F4/80+/VEGFR-3+macrophages in myocardial tissue of mice between the two groups表3 2组小鼠心肌组织中F4/80+/VEGFR-3+巨噬细胞比例的比较 （n=4，%）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

组别HS+L组HS+L+PBVM组t第1天14.62±0.28 17.58±1.96 2.990＊第2天14.92±0.39 24.67±0.74 23.310＊＊第3天14.96±0.31 27.83±0.98 25.040＊＊第5天15.07±0.23 24.76±3.46 5.589＊＊第7天14.89±0.86 17.26±1.35 2.961＊

Tab.4 The comparison of mRNA expression levels of phenotype markers of lymphatic endothelial cells and TonEBP between the four groups of mice表4 各组小鼠淋巴管内皮细胞表型标志物及TonEBP的mRNA表达水平比较 （n=3，）

Tab.4 The comparison of mRNA expression levels of phenotype markers of lymphatic endothelial cells and TonEBP between the four groups of mice表4 各组小鼠淋巴管内皮细胞表型标志物及TonEBP的mRNA表达水平比较 （n=3，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a与NS组比较，b与HS组比较，c与HS+L组比较，P＜0.05。

组别NS组HS组HS+L组HS+L+PBVM组F TonEBP 1.00±0.00 2.17±0.27a 2.87±0.82a 2.35±0.72a 5.906＊VEGF-C 1.00±0.00 1.88±0.41a 1.80±0.40a 3.16±0.55abc 15.260＊＊Prox-1 1.00±0.00 2.77±0.48a 2.56±0.45a 3.73±0.34abc 28.360＊＊Podoplanin 1.00±0.00 2.33±0.64a 2.41±0.49a 3.95±0.46abc 20.400＊＊LYVE-1 1.00±0.00 2.69±0.49a 2.88±0.55a 4.38±1.03abc 14.330＊＊

Fig.2 The representative images of M-mode ultrasound of mice in each group图2 各组小鼠心脏M型超声代表性图片

Tab.5 The comparison results of ultrasound indexes of mice between each group表5 各组小鼠心脏超声指标的比较结果（n=5

Tab.5 The comparison results of ultrasound indexes of mice between each group表5 各组小鼠心脏超声指标的比较结果（n=5

＊＊P＜0.01；a与NS组比较，b与HS组比较，c与HS+L组比较，P＜0.05。

组别NS组HS组HS+L组HS+L+PBVM组F LVEDD（mm）2.68±0.45 3.50±0.52a 4.03±0.15ab 3.25±0.06ac 12.540＊＊LVEF 0.65±0.03 0.48±0.04a 0.41±0.07ab 0.56±0.05abc 21.740＊＊LVFS 0.33±0.03 0.24±0.05a 0.19±0.02ab 0.27±0.03ac 17.120＊＊LVPWT（mm）0.76±0.11 0.88±0.06a 0.98±0.11a 0.75±0.08c 6.460＊＊

2.5 各组小鼠左心室心肌组织病理结果比较 与NS组比较，HS组、HS+L组及HS+L+PBVM组CSA及CVF显著增加，差异均有统计学意义（P＜0.05），左心室心肌细胞均有不同程度肥大，心肌间质纤维化程度增加。HS+L+PBVM组心肌CSA及CVF低于HS+L组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图3、表6。

3 讨论

高血压是心血管疾病最重要的危险因素之一［8］。随着对高血压发病机制研究的不断深入，高盐饮食与高血压的关系成为研究的热点［7，9-10］。长期高盐饮食不仅可以引起血压的升高，还可独立于血压水平引起靶器官的损伤［11-12］。由于人们高盐饮食习惯在短时间内难以改变，探索高盐摄入引起高血压及靶器官损伤的机制，以延缓高血压及靶器官的损伤进程尤为重要。

成年个体新生淋巴管的生成机制目前尚不清楚。有研究报道，外周血中有一部分组成性表达VEGFR-3的幼稚单核细胞，在特定条件下可以向2个方向分化，其中一部分在肿瘤坏死因子-α和（或）其他炎性因子的刺激下转化为能分泌VEGF-C的巨噬细胞，诱导淋巴管内皮细胞的增殖；另一部分可以分化整合到临近的淋巴管成为新的淋巴管内皮细胞［4-6］。笔者前期研究发现，长期的高盐饮食干预在引起SHR大鼠血压显著升高的同时，心肌巨噬细胞浸润程度及淋巴管的密度明显增加，并伴随着心肌细胞的肥大及心肌间质的纤维化，而通过调节巨噬细胞内TonEBP/VEGF-C信号通路引起心肌淋巴管的增生，可使巨噬细胞浸润程度减轻，并明显改善左心室重塑［2-3］。本研究发现，增加VEGFR-3+单核细胞比例可以改善高血压小鼠收缩压及左心室重塑，与此同时，心肌组织中淋巴管内皮细胞标志物表达水平也显著增高，提示VEGFR-3+单核细胞可能通过促进淋巴管的生成进而对血压及左心室重塑产生影响。

Fig.3 The representative images of WGA staining of left ventricular muscle of mice in each group图3 各组小鼠左心室肌WGA及Masson染色的代表性图片

Tab.6 The pathological staining analysis results of mice in each group表6 各组小鼠左室心肌CSA及CVF比较结果（n=4）

Tab.6 The pathological staining analysis results of mice in each group表6 各组小鼠左室心肌CSA及CVF比较结果（n=4）

＊＊P＜0.01；a与NS组比较，b与HS组比较，c与HS+L组比较，P＜0.05。

组别NS组HS组HS+L组HS+L+PBVM组F CSA（μm2）368.00±41.24 436.50±30.26a 592.00±24.12ab 498.00±36.89abc 31.750＊＊CVF（%）2.23±0.31 7.33±1.04a 16.15±2.07ab 10.83±1.27abc 77.560＊＊

关于促进淋巴管的增生可以改善高血压及左心室重塑的机制，主要考虑以下2个方面：（1）高血压状态下心脏淋巴回流受阻，组织液进入淋巴管以及淋巴液回流到静脉的过程均被抑制，引起心肌组织的淋巴水肿，淋巴水肿造成心肌间质压力的增高，而心肌组织水肿液中的蛋白成分也会刺激胶原纤维的合成和沉积，进而导致心肌组织纤维化的加重［13-14］。（2）长期高血压导致的心脏淋巴管的阻塞会引起心室肌细胞水肿、心肌纤维的变性、Z带及闰盘的破裂以及线粒体结构的紊乱等结构的改变，这些改变是心室重塑的重要原因［15］。长期的淋巴管阻塞造成的心肌间质水肿可能由于氧供应受限及诱导缺血而引起心功能的异常，最终引起心力衰竭［16］。本研究显示，通过促进淋巴管的生成，使得心肌间质压力及水肿程度减轻，可以改善心肌纤维化程度及心脏功能。

本研究也存在不足之处。首先，本研究利用FACSAria流式细胞分选系统分选VEGFR-3+单核细胞，分选过程可能会对细胞产生一定损伤，研究中也发现分选出来的细胞在培养过程中会有部分死亡，如采用磁珠分选可能会减少细胞损伤，提高实验效率；其次，本研究干预策略是将VEGFR-3+单核细胞回输给高血压小鼠，为了减少对细胞的损伤，利用流式细胞术分析间接证实了VEGFR-3+单核细胞可进入心肌组织，而采用细胞示踪技术能更直观地观察回输VEGFR-3+单核细胞在体内的活动轨迹；再者，本研究观察了VEGFR-3+单核细胞对高血压小鼠血压及左心室重塑的影响，但并未对其机制进行深入探讨，需要进一步研究证实。

总之，本研究以高盐诱导的高血压小鼠为研究对象，观察了VEGFR-3+单核细胞对高血压性左心室重塑的影响，结果提示通过调节VEGFR-3+单核细胞可以改善高血压小鼠收缩压与左心室重塑，为今后高血压及靶器官损伤的防治研究提供了参考。