m6A识别蛋白HuR调控lncRNA TRG-AS1抑制结直肠癌生长的机制研究

柴小兵，张利，褚菲菲，吴慧丽

结直肠癌（CRC）是一种侵袭性癌症，发生在结肠或直肠，是全球第三大常见恶性肿瘤［1］。尽管治疗CRC可采取手术、化学疗法、放射疗法和分子疗法，但CRC患者的存活率仍然较低［2-3］。因此，深入了解CRC的发病机制对于制定新的治疗策略和改善CRC患者的预后具有重要意义。近年来，RNA甲基化修饰尤其是N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）甲基化修饰被证实在肿瘤的进展中发挥重要作用。m6A甲基化修饰是一个动态过程，主要受甲基化转移酶复合物、去甲基化酶、结合蛋白的调控［4］。人类抗原R（HuR）是m6A甲基化修饰的识别蛋白。HuR在CRC中高表达，沉默HuR可抑制CRC细胞转移［5］。但其具体调控机制尚不完全明确。生物信息分析显示，长链非编码RNA（lncRNA）T细胞受体γ位点反义RNA1（T cell receptor gamma locus antisense RNA1，TRG-AS1）上存在m6A位点，且TRG-AS1能与HuR蛋白相互作用。相关研究显示，沉默TRG-AS1可明显抑制肝癌细胞增殖、迁移、侵袭［6］。但HuR能否通过调控TRG-AS1影响CRC细胞恶性生物学行为尚不明确。因此，本研究旨在探究HuR对CRC细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 收集2019年5月—2021年5月在郑州大学附属郑州中心医院首次确诊为CRC患者的癌组织以及距离癌组织3 cm处的癌旁组织，共19对。所有组织收集后立即冻存于液氮中。患者均签署知情同意书，本研究得到郑州大学附属郑州中心医院伦理委员会的批准（伦理号：201901）。人正常结肠上皮细胞NCM460及CRC细胞HCT116、SW480、LO⁃VO均购自上海佰晔生物科技中心。35只5周龄的雌性BALB/c裸鼠购自广州锐格生物科技有限公司［生产许可证号：SCXK（粤）2021-0059］。HuR小干扰RNA（si-HuR，序列：5′-UCAAAGACGCCAACUUGUA-3′）及其阴性对照（si-NC，序列：5′-UAAGGCUAUGAAGAGAUAC-3′）、HuR过表达物（OE-HuR）及其阴性对照（OE-NC）、TRG-AS1过表达物（pcDNA-TRG-AS1）及其阴性对照（pcDNA）均购自河南睿英生物公司；DMEM培养基、胎牛血清购自武汉益普生物公司；EpiQuik M6A RNA甲基化定量检测试剂盒（比色法）购自厦门慧嘉生物公司；CCK-8试剂盒购自杭州昊鑫生物公司；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自翌圣生物科技公司；兔源一抗HuR、m6A、IgG、GAPDH及羊抗兔IgG二抗均购自英国Abcam公司。ABI-7500实时荧光定量PCR仪购自北京赛百奥科技有限公司；蛋白电泳仪购自北京六一生物科技有限公司；FK-SY96A酶标仪购自山东方科仪器有限公司；流式细胞仪购自上海睿钰生物公司；XDS-100D型倒置光学显微镜购自上海蔡康光学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将NCM460、HCT116、SW480、LOVO细胞置于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，并在37℃、5%CO2条件下培养。

1.2.2 比色法检测m6A含量 按照EpiQuik m6A RNA甲基化定量检测试剂盒（比色法）说明书检测组织和细胞中的m6A含量。

1.2.3 实时荧光定量PCR（qPCR）检测组织和细胞中TRGAS1表达 使用TRIzol提取组织和细胞中RNA，将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板在ABI-7500实时荧光定量PCR仪上进行实时荧光定量PCR。反应体系：上、下游引物各1μL，cDNA模板1μL，SYBR premix 10μL，补无菌水至总体积为20μL。反应条件：95℃预变性10 min；95℃变性10 s，60℃退火30 s，共45个循环。以GAPDH为内参，通过2-ΔΔCt法计算TRG-AS1的表达水平。引物及序列见表1。

Tab.1 qPCR primer sequences表1 qPCR引物序列

1.2.4 Western blot检测组织和细胞中HuR蛋白的表达 在冰上用RIPA裂解缓冲液裂解组织匀浆和细胞30 min，10 000 r/min离心20 min，收集上清液，通过BCA试剂盒检测蛋白质浓度，将30μg蛋白质进行10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳分离后将蛋白质转移到PVDF膜上，再用5%脱脂奶粉封闭1 h，经TBST洗涤后，将PVDF膜与一抗HuR（1∶2 000）、GAPDH（1∶1 000）在4℃下孵育过夜，再加入二抗（1∶1 000）在常温下孵育1.5 h。加入ECL试剂观察蛋白条带，以GAPDH为内参，通过Quantity One软件计算蛋白灰度值。

1.2.5 细胞分组 OE-NC、OE-HuR、si-NC、si-HuR、si-HuR+pcDNA、si-HuR+pcDNA-TRG-AS1分别转染于对数生长期的HCT116细胞，命名为OE-NC组、OE-HuR组、si-NC组、si-HuR组、si-HuR+pcDNA组、si-HuR+pcDNA-TRG-AS1组，另取正常培养的HCT116细胞作为Ct组，转染48 h后，用于后续实验。

1.2.6 CCK-8法检测细胞增殖 将各组细胞以1×104个/孔接种在96孔板中培养48 h后，加入10μL CCK-8试剂。孵育2 h后，使用酶标仪测量450 nm处的光密度（OD）。

1.2.7 平板克隆实验检测细胞克隆形成能力 将350个HCT116细胞接种于6 cm细胞培养板中，在含有10%FBS的DMEM培养基中培养15 d。弃培养液，将细胞用甲醇固定、0.1%结晶紫染色，并观察克隆形成情况。克隆形成率（%）=（克隆数/接种细胞数）×100%。

1.2.8 流式细胞术检测细胞凋亡率 将1×105个细胞重悬于100μL结合缓冲液中。用5μL Annexin V-FITC和5μL碘化丙啶溶液对细胞进行双重染色。使用流式细胞仪测定细胞凋亡率。将第二、三象限的细胞定为凋亡细胞，细胞凋亡率=（凋亡细胞数/总细胞数）×100%。

1.2.9 划痕愈合实验检测细胞迁移 将各组细胞以1×106个/孔接种于6孔板中，当细胞汇合度达到100%时，使用100μL移液器吸头刮擦细胞层以制造划痕，并将含10%FBS的DMEM培养基替换为无FBS的DMEM培养基，观察细胞在0、48 h时的划痕愈合情况。划痕愈合率（%）=（0 h划痕宽度-48 h划痕宽度）/0 h划痕宽度×100%。

1.2.10 Transwell检测细胞侵袭 Transwell小室上室预涂有Matrigel，将含有5×104个细胞的细胞悬浮液添加到孔径为8μm的Transwell上室中。下室填充有600μL含有10%FBS的DMEM培养基。孵育48 h后，去除上表面残留的细胞，侵袭的细胞用4%多聚甲醛固定，0.5%结晶紫染色。在倒置光学显微镜下对染色的细胞进行拍照和计数。

1.2.11 裸鼠体内移植瘤实验 将1.2.5中的各组细胞以5×105个悬浮在100μL PBS中，然后通过右侧腋窝皮下接种于小鼠体内，并命名为裸鼠Ct组、裸鼠OE-NC组、裸鼠OEHuR组、裸鼠si-NC组、裸鼠si-HuR组、裸鼠si-HuR+pcDNA组、裸鼠si-HuR+pcDNA-TRG-AS1组，每组5只。注射40 d后，处死裸鼠并分离出肿瘤，称量肿瘤质量。

1.2.12 甲基化RNA免疫共沉淀（MeRIP）检测TRG-AS1上是否存在m6A位点 分离HCT116细胞的RNA，磁珠在室温下用5μg抗m6A抗体或抗IgG抗体包被30 min。然后，将抗体包被的珠子与50μg总RNA在4℃下孵育过夜。经蛋白酶K消化后，通过苯酚/氯仿/异戊醇法提取沉淀m6A结合的RNA，通过qPCR检测TRG-AS1的表达量，方法同1.2.3。

1.2.13 RNA pull-down实验检测HuR与TRG-AS1结合 将生物素化的TRG-AS1阴性对照（NC）和TRG-AS1分别转染到HCT116中。48 h后，将细胞裂解液与链酶亲和素标记的磁珠混合形成蛋白质-生物/RNA-磁珠复合物，用高盐洗脱得到蛋白质-生物/RNA复合物，分别命名为bio-NC组、bio-TRG-AS1组，以Input作为阳性对照。Western blot检测HuR蛋白在蛋白质-生物/RNA混合物中的表达，方法同1.2.4。

1.2.14 RIP检测TRG-AS1与HuR蛋白结合 在RIP裂解缓冲液中裂解细胞，利用蛋白A/G磁珠对HuR抗体进行免疫沉淀，用磁铁固定与复合物结合的磁珠并洗掉未结合的部分，提取RNA，通过qPCR分析TRG-AS1的相对表达量，IgG蛋白作为对照参考。

1.3 统计学方法 使用GraphPad Prism 5.0进行数据分析，所有数据均采用均数±标准差（）表示。2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 m6A含量、TRG-AS1和HuR蛋白在组织中的表达 与癌旁组织比较，癌组织中HuR蛋白、TRGAS1表达升高，m6A含量降低（P＜0.05），见图1、表2。

Fig.1 Western blot detection of HuR protein expression in tissue图1 Western blot检测组织中HuR蛋白表达

Tab.2 Comparison of HuR protein,m6A content and TRG-AS1 expression in cancer and adjacent tissues表2癌组织和癌旁组织HuR蛋白、m6A含量和TRG-AS1表达比较 （n=19）

Tab.2 Comparison of HuR protein,m6A content and TRG-AS1 expression in cancer and adjacent tissues表2癌组织和癌旁组织HuR蛋白、m6A含量和TRG-AS1表达比较 （n=19）

＊＊P＜0.01。

组别癌旁组织癌组织t HuR蛋白0.42±0.03 1.35±0.21 19.110＊＊m6A含量（%）0.92±0.08 0.31±0.02 32.244＊＊TRG-AS1 1.00±0.00 2.22±0.21 25.323＊＊

2.2 m6A含量、TRG-AS1和HuR蛋白在细胞中的表达 与NCM460细胞比较，HCT116、SW480、LOVO细胞中HuR蛋白、TRG-AS1表达升高，m6A含量减少（P＜0.05），且HCT116细胞中HuR蛋白、TRG-AS1表达高于SW480、LOVO细胞，m6A含量低于SW480、LOVO细胞（P＜0.05），选择HCT116细胞为后续实验研究对象，见图2、表3。

2.3 m6A含量、HuR蛋白、TRG-AS1在各组HCT116细胞中的表达 与Ct组、OE-NC组比较，OE-HuR组的HCT116细胞中HuR蛋白、TRG-AS1表达升高，m6A含量降低（P＜0.05）；与Ct组、si-NC组比较，si-HuR组HCT116细胞中HuR蛋白、TRG-AS1表达降低，m6A含量升高（P＜0.05）；与si-HuR组、si-HuR+pcDNA组比较，si-HuR+pcDNA-TRG-AS1组HCT116细胞中HuR蛋白、m6A含量差异无统计学意义，TRG-AS1表达升高（P＜0.05），见图3、表4。

Fig.2 Western blot detection of HuR protein expression in cells图2 Western blot检测细胞中HuR蛋白表达

Tab.3 Comparison of m6A content,HuR protein and TRG-AS1 expression between normal colonic epithelial cells and CRC cells表3正常结肠上皮细胞及CRC细胞m6A含量、HuR蛋白、TRG-AS1表达比较 （n=6，s）

Tab.3 Comparison of m6A content,HuR protein and TRG-AS1 expression between normal colonic epithelial cells and CRC cells表3正常结肠上皮细胞及CRC细胞m6A含量、HuR蛋白、TRG-AS1表达比较 （n=6，s）

＊＊P＜0.01；a与NCM460细胞比较，b与HCT116细胞比较，P＜0.05。

组别NCM460 HCT116 SW480 LOVO F TRG-AS1 1.00±0.00 2.58±0.24a 2.27±0.22ab 2.04±0.23ab 70.881＊＊HuR 0.36±0.03 1.48±0.23a 1.21±0.20ab 1.01±0.09ab 53.645＊＊m6A含量（%）1.23±0.11 0.27±0.02a 0.38±0.03ab 0.46±0.04ab 305.547＊＊

2.4 过表达或沉默HuR对HCT116细胞增殖、凋亡的影响 与Ct组、OE-NC组比较，OE-HuR组HCT116细胞OD450值、克隆形成率升高，细胞凋亡率降低（P＜0.05）；与Ct组、si-NC组比较，si-HuR组HCT116细胞OD450值、克隆形成率降低，细胞凋亡率升高（P＜0.05）；与si-HuR组、si-HuR+pcDNA组比较，si-HuR+pcDNA-TRG-AS1组HCT116细胞OD450值、克隆形成率升高，细胞凋亡率降低（P＜0.05），见图4、5，表5。

Fig.3 Western blot detection of HuR protein expression in HCT116 cells图3 Western blot检测HCT116细胞中HuR蛋白表达

Tab.4 Comparison of HuRprotein,m6Acontent and TRGAS1 expression in HCT116 cells between the seven groups表4各组HCT116细胞中的HuR蛋白、m6A含量、TRG-AS1表达比较 （n=6）

Tab.4 Comparison of HuRprotein,m6Acontent and TRGAS1 expression in HCT116 cells between the seven groups表4各组HCT116细胞中的HuR蛋白、m6A含量、TRG-AS1表达比较 （n=6）

＊＊P＜0.01；a与Ct组比较，b与OE-NC组比较，c与si-NC组比较，d与si-HuR组比较，e与si-HuR+pcDNA组比较，P＜0.05；表5、6同。

组别Ct组OE-NC组OE-HuR组si-NC组si-HuR组si-HuR+pcDNA组si-HuR+pcDNA-TRG-AS1组F HuR 1.46±0.21 1.47±0.22 1.98±0.25ab 1.45±0.22 0.35±0.03ac 0.35±0.04 0.36±0.03 95.617＊＊m6A含量（%）0.28±0.03 0.26±0.02 0.10±0.01ab 0.27±0.01 1.12±0.08ac 1.14±0.09 1.13±0.10 381.869＊＊TRG-AS1 1.00±0.00 1.02±0.08 2.34±0.22ab 1.01±0.09 0.71±0.12ac 0.69±0.13 0.94±0.11de 125.637＊＊

Fig.4 Effects of silencing or overexpression of HuR on HCT116 cell clone formation图4 沉默或过表达HuR对HCT116细胞克隆形成的影响

Fig.5 Effects of silencing or overexpression of HuR on apoptosis of HCT116 cells detected by Annexin V-FITC/PI double staining图5 Annexin V-FITC/PI双重染色检测沉默或过表达HuR对HCT116细胞凋亡的影响

Tab.5 Comparison of OD450 value,clone formation rate and apoptosis rate between different groups of HCT116 cells表5 各组HCT116细胞OD450值、克隆形成率、细胞凋亡率比较 （n=6）

Tab.5 Comparison of OD450 value,clone formation rate and apoptosis rate between different groups of HCT116 cells表5 各组HCT116细胞OD450值、克隆形成率、细胞凋亡率比较 （n=6）

组别Ct组OE-NC组OE-HuR组si-NC组si-HuR组si-HuR+pcDNA组si-HuR+pcDNA-TRG-AS1组F OD450值0.82±0.08 0.83±0.09 1.25±0.12ab 0.84±0.08 0.32±0.02ac 0.33±0.03 0.69±0.05de 112.818＊＊克隆形成率（%）62.23±5.14 63.15±5.09 83.36±6.05ab 62.78±5.16 26.69±2.44ac 26.75±2.38 48.87±4.12de 126.394＊＊细胞凋亡率（%）41.27±3.68 42.26±3.71 24.48±2.39ab 42.33±5.08 65.54±5.62ac 64.57±5.41 46.67±3.08de 67.001＊＊

2.5 过表达或沉默HuR对HCT116细胞迁移、侵袭的影响 与Ct组、OE-NC组比较，OE-HuR组HCT116细胞划痕愈合率、侵袭细胞数目升高（P＜0.05）；与Ct组、si-NC组比较，si-HuR组HCT116细胞划痕愈合率、侵袭细胞数目降低（P＜0.05）；与si-HuR组、si-HuR+pcDNA组比较，si-HuR+pcDNATRG-AS1组HCT116细胞划痕愈合率、侵袭细胞数目升高（P＜0.05），见表6，图6、7。

2.6 过表达或沉默HuR对裸鼠体内移植瘤生长的影响 各组间移植瘤质量差异有统计学意义（F=210.787，P＜0.01）。与Ct组（0.28 g±0.02 g）、OE-NC组（0.29 g±0.01 g）比较，OE-HuR组（0.56 g±0.04 g）裸鼠体内移植瘤质量升高（P＜0.05）；与Ct组、si-NC组（0.30 g±0.03 g）比较，si-HuR组（0.12 g±0.01 g）裸鼠体内移植瘤质量降低（P＜0.05）；与si-HuR组、si-HuR+pcDNA组（0.13 g±0.01 g）比 较，si-HuR+pcDNA-TRG-AS1组（0.22 g±0.02 g）裸鼠体内移植瘤质量升高（P＜0.05），见图8。

Tab.6 Comparison of wound healing rate and the number of invasive cells between different groups of HCT116 cells表6 各组HCT116细胞划痕愈合率、侵袭细胞数目比较（n=6）

Tab.6 Comparison of wound healing rate and the number of invasive cells between different groups of HCT116 cells表6 各组HCT116细胞划痕愈合率、侵袭细胞数目比较（n=6）

组别Ct组OE-NC组OE-HuR组si-NC组si-HuR组si-HuR+pcDNA组si-HuR+pcDNA-TRG-AS1组F划痕愈合率（%）51.17±4.66 51.28±5.02 69.44±6.24ab 51.34±5.13 21.25±2.06ac 21.36±2.09 36.67±3.24de 100.512＊＊侵袭细胞数目（个）74.43±6.25 74.58±6.12 113.35±10.04ab 73.96±6.11 27.75±2.16ac 28.14±2.02 51.14±4.33de 159.505＊＊

2.7 HuR识别并结合TRG-AS1上的m6A修饰位点 RMVar数据库（https://rmvar.renlab.org/）提示TRG-AS1上存在潜在的m6A位点，见图9。MeRIP结果表明，存在m6A抗体时能够富集到大量TRGAS1（18.62±1.03），而对照IgG富集到极少量TRGAS1（0.25±0.02），差异有统计学意义（t=43.678，P＜0.01），表明TRG-AS1上存在m6A位点。RNA下拉实验结果表明，TRG-AS1能与HuR蛋白相互作用，见图10。RIP实验结果表明IgG蛋白（4.15±0.32）富集到的TRG-AS1明显低于HuR抗体（23.68±2.11）（t=22.416，P＜0.01）。

Fig.6 The effect of silencing or overexpressing HuR on the migration of HCT116 cells图6 沉默或过表达HuR对HCT116细胞迁移的影响

3 讨论

Fig.7 The effect of silencing or overexpressing HuR on the invasion of HCT116 cells(crystal violet dyeing,×200)图7 沉默或过表达HuR对HCT116细胞侵袭的影响（结晶紫染色，×200）

Fig.8 Comparison of tumor quality in each group图8 各组移植瘤质量比较

Fig.9 RMVar database showing potential m6A sites on TRG-AS1图9 RMVar数据库显示TRG-AS1上存在潜在的m6A位点

Fig.10 RNA pull-down experiments showing HuR binds to TRG-AS1图10 RNA下拉实验表明HuR与TRG-AS1结合

m6A修饰是最常见的RNA甲基化事件之一，主要参与mRNA和非编码RNA的剪接、运输、稳定和降解过程［7］。越来越多的证据表明，m6A修饰在人类不同的癌症中发挥着关键作用。如肝癌组织中m6A含量低于癌旁组织［8］；白血病耐药细胞株中m6A含量低于白血病细胞株［9］，表明m6A修饰在肝癌、白血病等肿瘤中能够影响肿瘤发生和病理进程。m6A甲基化修饰的识别蛋白HuR在胶质瘤组织中呈高表达状态，上调HuR可促进胶质瘤细胞增殖，抑制细胞凋亡［10］；下调HuR抑制了肝癌细胞的增殖、迁移与侵袭［11］；低表达HuR可以抑制胃癌MGC-803细胞的侵袭、迁移［12］；敲低HuR可以抑制CRC细胞转移［13］。由此表明HuR在多种肿瘤中具有致癌的作用。本研究结果与既往研究一致，在CRC组织和细胞中HuR蛋白高表达，m6A含量降低，且HCT116细胞中HuR蛋白表达量最高，m6A含量最低，因此选择HCT116细胞为研究对象进行转染实验。此外，本研究还发现，过表达HuR可促进HCT116细胞增殖、迁移、侵袭及体内移植瘤的生长，抑制细胞凋亡，降低m6A含量；而沉默HuR则呈相反趋势，证实HuR可通过调节m6A含量影响HCT116细胞恶性生物学行为。

HuR通过识别靶基因的m6A位点发挥其功能［14］。为确认HuR下游靶基因，本研究通过生物信息分析显示TRG-AS1上存在m6A位点。TRG-AS1是一种lncRNA，下调TRG-AS1抑制舌鳞状细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡［15］；过表达TRG-AS1可促进胶质母细胞瘤细胞增殖［16］；上调TRG-AS1可促进肺癌细胞增殖和侵袭［17］。以上研究表明TRG-AS1在舌鳞状细胞癌、胶质母细胞瘤、肺癌等肿瘤中发挥癌基因的作用。而关于TRGAS1在CRC中的研究鲜有报道。本研究显示，TRGAS1在CRC组织和细胞中高表达，过表达HuR后，HCT116细胞中TRG-AS1表达升高，m6A含量降低；沉默HuR后，HCT116细胞中TRG-AS1表达降低，m6A含量升高；且MeRIP结果表明TRG-AS1上存在m6A位点，RNA pull-down和RIP实验结果表明TRG-AS1能与HuR蛋白相互作用，推测沉默HuR可能通过识别TRG-AS1上的m6A位点来抑制TRGAS1表达进而抑制HCT116细胞增殖、迁移、侵袭及体内移植瘤的生长，促进细胞凋亡。为验证该推测，本研究在沉默HuR的基础上增加pcDNA-TRG-AS1来干预HCT116细胞，结果显示，pcDNA-TRG-AS1减弱了沉默HuR对HCT116细胞增殖、迁移、侵袭及体内移植瘤生长的抑制作用，以及对细胞凋亡的促进作用。

综上所述，沉默HuR可通过抑制TRG-AS1表达进而抑制HCT116细胞增殖、迁移与侵袭，促进细胞凋亡。本研究将TRG-AS1鉴定为HuR介导的m6A修饰的新型下游效应子，证实了m6A修饰在调节lncRNA的生物过程发生中的关键作用，并表明TRG-AS1可能成为治疗CRC的潜在靶点，为CRC进展的潜在机制提供了新线索。