不同方法分析十大功劳中生物碱类成分的比较

黄明浩，李光伟，桂正杰，黄泰奇

(1 武汉东湖学院生命科学与化学学院，湖北 武汉 430212；2 武汉科技大学医学院，湖北 武汉 430065)

功劳木MahoniaeCaulis为小檗科植物阔叶十大功劳Mahoniabealaei(Fort.)Carr.和狭叶十大功劳Mahoniafortunei(Lindl.)Fedde的茎干[1]。全国各地均有分布，且主要分布于四川、云南、贵州和西藏东南部。其性寒，味苦，具有清热燥湿、泻火解毒的功效，用于治疗湿热泻痢、黄疸、目赤胀痛、胃火牙痛[2]。现代研究表明，阔叶十大功劳中所含化学成分主要为生物碱类，此外还有黄酮类及挥发油类等，药理活性主要为抗氧化、抗炎和抑菌等[3]。近年来，十大功劳中生物碱类成分分析方法报道有HPLC法、紫外分光光度法、酸性染料比色法，为了比较不同方法的优劣，笔者在本研究中采用HPLC法测定不同产地15批功劳木药材中药根碱、巴马汀、小檗碱的含量，以三者之和为总生物碱含量。同时用紫外分光光度法测定总生物碱，以期为十大功劳药材及相关成药的质量控制提供思路及参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪 器

LY22-500A型超声波清洗机，上海兰仪实业有限公司；LC-100高效液相色谱仪，伍丰；600A粉碎机，浙江荣浩工贸有限公司；分析天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；SHZ-D循环水真空泵，郑州杜甫仪器厂；普通天平，上海衡平仪器仪表厂；SP-1901UV型紫外可见光度计，上海光谱仪器厂。

1.2 试 药

实验所用十大功劳药材经武汉东湖学院金卫华讲师鉴定为小檗科植物阔叶十大功劳Mahonia bealei (Fort.)Carr.或细叶十大功劳Mahonia fortunei (Lindi.)Fedde的干燥根茎；小檗碱标准品(批号：AF9102103)，成都埃法生物；盐酸药根碱标准品(批号：20220327001)，颖心实验室；巴马汀标准品(批号：220211Y)，道斯夫生物；甲醇、乙腈均为色谱纯，乙醇、氢氧化钠以及盐酸、磷酸均出自国药集团化学试剂有限公司，纯度均为分析纯或色谱纯。

2 实验方法

2.1 色谱条件

参考文献[4]并稍微作调整。色谱柱：Welch Materials XB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸水溶液25∶75；流速：0.8 mL/min，检测波长：284 nm，柱温：35 ℃，进样量：20 μL。

2.2 溶液的制备

混合对照品溶液：精密称取减压干燥至恒重的小檗碱、巴马汀、盐酸药根碱，制成小檗碱、巴马汀、盐酸药根碱质量浓度分别为41.2、123.2、8.24 μg/mL的混合溶液。

供试品溶液：取粉碎过50目筛的十大功劳样品粉末0.50 g，加入50 mL容量瓶中，加入3∶7的1 mol/L HCl-甲醇定容到刻度线，超声提取1 h，超声完毕补充至刻度线。

结果供试品溶液色谱中，在与混合对照品溶液相同保留时间处有相应色谱峰，目标峰分离良好，详见图1。

图1 高效液相色谱图

2.3 液相色谱方法学检验

2.3.1 线性关系考察

取10.3 mg盐酸药根碱，于25 mL容量瓶中，加1∶1 1%盐酸-甲醇超声溶解定容，从中取0.1、0.4、0.8、1 mL，1∶1 1%盐酸-甲醇定容于5 mL容量瓶中，即浓度分别为8.24、32.96、65.92、82.4 μg/mL，取8.24 μg/mL 1 mL，再次用1∶1 1%盐酸-甲醇定容到5 mL，即1.648 μg/mL；取15.4 mg巴马汀，1∶1 1%盐酸-甲醇超声溶解定容到50 mL，即浓度为308 μg/mL。从中取4 mL，定容到10 mL容量瓶中，即浓度为123.2 μg/mL。从中取0.1、0.2、0.4、0.6 mL定容到5 mL，即浓度分别为2.464、4.928、9.856、14.784 μg/mL。取10.3 mg小檗碱，1∶1 1%盐酸-甲醇超声溶解定容到100 mL，即浓度为103 μg/mL。从中取4 mL，定容到10 mL容量瓶中，即浓度为41.2 μg/mL。从中取0.1、0.2、0.4、0.6 mL定容到5 mL，即浓度分别为0.824、1.648、3.296、4.944 μg/mL。取上述不同浓度的标准品溶液，按2.1中色谱条件进样，绘制峰面积-浓度标准曲线，详见表1。

表1 3种生物碱的标准曲线

2.3.2 精密度试验

取同一对照品溶液，连续进样6次，每次20 μL，记录峰面积。结果见表2，表明仪器精密度良好。

表2 精密度、稳定性、重复性及加样回收试验结果

2.3.3 稳定性试验

按2.2项下方法制备供试品溶液，取同一供试品溶液，分别于0，4，8，12，18，24 h时进样20 μL，按2.1项下色谱条件测定峰面积。结果见表2，表明24 h内供试品溶液稳定。

2.3.4 重复性试验

取2.2项下供试品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积，计算含量。结果见表2，表明方法重复性良好。

2.3.5 加样回收试验

称取已知含量的十大功劳粉末6份，各0.5 g，精密称定，分别精密加入一定量的相应对照品，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，并计算加样回收率，结果见表2。

2.4 紫外分光光度法测定十大功劳中总生物碱含量

2.4.1 测定波长的验证

参考文献[5]取样品溶液和103 μg/mL的盐酸小檗碱甲醇溶液各0.05 mL，加3∶7的1 mol/L HCl-甲醇定容稀释到5 mL，在200～400 nm范围内进行波长扫描。确定二者在345 nm波长处均存在吸收峰，与文献[5]值一致，故选择测定波长为345 nm。

2.4.2 标准曲线

精密吸取0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6 mL的103 μg/mL的小檗碱甲醇溶液加3∶7的1 mol/L HCl-甲醇定容稀释到5 mL，于345 nm波长下测定吸光值，绘制吸光值-浓度标准曲线。小檗碱在浓度为1.03～12.36 μg/mL范围内线性关系良好，回归方程为y=0.069 4x+0.022，相关系数r=0.999 6。

2.4.3 样品中总生物碱含量测定

精密吸取2.2中供试品溶液0.05 mL，加3∶7的1 mol/L HCl-甲醇定容稀释到5 mL，于345 nm波长下测定吸光值，根据回归方程计算样品中总生物碱含量，结果见表3。

表3 样品中总生物碱含量测定

3 结果与讨论

3.1 液相色谱检测

3.1.1 样品和混合标准品液相色谱图

由图1可知，三种生物碱色谱峰分离程度良好，基线稳定。

3.1.2 方法学检验结果

由表1、表2可知，三种生物碱线性关系良好，且该检测方法稳定可行。

3.2 样品中生物碱含量测定结果

根据《中国药典》2020版[1]标准要求，总生物碱含量应不低于1.5%，故15个样品中共两个样品不合格(见表3)，而分光光度法测定总生物碱结果中共3个样品数值异常——低于液相色谱测定的含量，通过对三种生物碱和样品溶液进行光谱扫描可知，样品溶液和小檗碱、巴马汀在345 nm波长处存在吸收峰，药根碱吸收峰在325 nm、360 nm处，345 nm处无吸收峰(如图2所示)，故紫外分光光度法对于药根碱含量远高于其他两种生物碱的样品分析可能存在一定的误差。此外，由于中药成分复杂，紫外分光光度法在单一波长分析时，杂质对分析结果干扰较大[6]。另外，笔者曾尝试酸性染料比色法测定样品中总生物碱，但发现该法稳定性极差。根据《中国药典》2020版[1]标准要求，十大功劳药材评价要求除文中提到三种生物碱外，还有非洲防己碱，但非洲防己碱价格昂贵，且色谱条件要求梯度洗脱，同时，文献[7]中27批样品非洲防己碱含量最大值、最小值分别为0.312%、0.016%，方差、平均值分别为0.079%、0.130%，含量远小于文中所用三种生物碱，故其含量对总生物碱含量计算影响较小，因此，本文未测定样品中的非洲防己碱含量。综上所述，十大功劳药材质量评价仍应选择HPLC法。

图2 三种生物碱和样品光谱扫描图