宫颈局部IFI16、STAT1蛋白、T-bet蛋白表达与HPV16/18感染转归相关性及联合检测价值分析*

潘晓伟，史鹏飞，任海霞，陈何伟，王宏卫

石家庄市人民医院妇科，河北石家庄 050011

人乳头瘤病毒(HPV)16/18持续感染是宫颈癌发生的重要始动因素之一，故促进HPV16/18感染转阴意义重大[1]。目前临床处理HPV16/18感染手段包括药物、高强度聚焦超声(HIFU)、宫颈环形电切术(LEEP)等，但即使是病情相似患者，接受相同治疗方法后，HPV16/18感染转归情况亦不尽相同，提示有其他因素参与了HPV16/18感染转归情况[2-3]。干扰素诱导蛋白16(IFI16)可选择性表达于上皮细胞，调控细胞周期、细胞分化、免疫调节等，在宫颈癌组织中IFI16蛋白表达高于癌前病变及健康对照人群[4-5]。信号传导和转录激活因子1(STAT1)蛋白在多种癌症中表达异常，HPV16感染患者STAT1蛋白阳性表达率明显升高，与宫颈病变进展有关[6]。T-box基因家族的新型转录因子T-bet蛋白选择性表达于Th1细胞、树突状细胞、巨噬细胞等，可增加机体抗病毒感染能力[7]。当前关于宫颈局部IFI16、STAT1蛋白、T-bet蛋白相对表达水平与HPV16/18感染转归相关性报道较少，本研究对此进行探讨，并分析三者联合检测对HPV16/18感染转归的预测价值，以期为临床处理HPV16/18感染提供参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2020年5月至2021年12月本院收治的110例HPV16/18感染患者作为研究对象，其中HPV16感染58例，HPV18感染42例，双重感染10例；宫颈细胞学诊断报告未见上皮内瘤样病变及恶性细胞(NMIL)32例，意义不明的不典型鳞状细胞(ASCUS)41例，低度鳞状上皮内病变(LSIL)37例。纳入标准：(1)HPV16(+)和/或HPV18(+)；(2)宫颈细胞学诊断报告NMIL、ASCUS或LSIL；(3)自愿加入本研究；(4)首次检出HPV16/18感染。排除标准：(1)既往有宫颈癌史；(2)拒绝接受治疗；(3)有宫颈、子宫手术史；(4)伴明显全身炎症、感染疾病。本研究经伦理委员会审批，患者自愿签署知情同意书。

1.2治疗方法 研究对象均根据病情并结合患者意愿给予药物、HIFU、LEEP治疗，治疗后6个月采用实时荧光聚合酶链反应法检测HPV-DNA(试剂盒购于广东凯普生物科技有限公司，可检测14种高危型及6种低危型)，HPV16/18感染患者治疗前在有感染型号相对的膜芯片位点上可见黑色斑点显示，治疗后转阴患者在对应膜芯片位点无黑色斑点显示。研究对象根据治疗后6个月HPV16/18感染转归情况分为转阴组(60例)、未转阴组(50例)。

1.3IFI16、STAT1蛋白、T-bet蛋白检测 采用免疫印迹法检测IFI16、STAT1蛋白、T-bet蛋白表达，治疗前使用专用宫颈刷，以宫颈口为圆心，顺时针旋转3圈，加入裂解液，匀浆器匀浆提取总蛋白，离心15 min(4 ℃ 13 000 r/min)，分离上清液。制作标准曲线，聚丙烯酰胺凝胶电泳，完成电泳后分割胶条至合适大小，转膜缓冲液平衡，将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，50%甲醇脱色至背景清晰，双蒸水洗。洗膜(3次×5 min)，加入一抗，4 ℃放置12 h，弃一抗，洗膜(4次×5 min)，加入辣根过氧化物酶偶联的二抗，室温放置2 h，弃二抗，洗膜(4次×5 min)。化学发光显影、定影，用凝胶图像处理系统分析目标带的分子量，以相对内参表达量作为IFI16、STAT1蛋白、T-bet蛋白表达，以上所用试剂均购于大连宝生物科技，各步骤均按试剂盒说明书进行操作。

1.4观察指标 (1)两组一般资料比较。(2)两组宫颈局部IFI16、STAT1蛋白、T-bet蛋白表达比较。(3)分析HPV16/18感染转归相关因素。(4)分析IFI16、STAT1蛋白、T-bet蛋白及联合检测预测HPV16/18感染转归价值。(5)IFI16、STAT1蛋白、T-bet蛋白高表达与低表达患者转阴率比较。

2 结 果

2.1两组一般资料比较 两组年龄、体重指数、HPV16/18感染情况、宫颈细胞学诊断、生育史、性伴数量、文化程度比较，差异无统计学意义(P>0.05)。未转阴组有阴道炎患者占比多于转阴组，差异有统计学意义(P<0.05)；两组采用不同治疗方法的患者占比比较,差异有统计学意义(P<0.05)；转阴组采取HIFU、LEEP治疗方法的患者占比与采取药物治疗方法的患者占比比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组一般资料比较

续表1 两组一般资料比较

2.2两组宫颈局部IFI16、STAT1蛋白、T-bet蛋白表达 未转阴组IFI16、STAT1蛋白表达高于转阴组，T-bet蛋白表达低于转阴组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2、图1。

表2 两组宫颈局部IFI16、STAT1蛋白、T-bet蛋白表达

图1 两组宫颈局部IFI16、STAT1蛋白、T-bet蛋白表达

2.3HPV16/18感染转归的多因素Logistic回归分析 将HPV16/18感染转归情况作为因变量(转阴赋值0，未转阴赋值1)，纳入阴道炎(无赋值0，有赋值1)、治疗方法(药物赋值1，HIFU或LEEP赋值2)、IFI16、STAT1蛋白、T-bet蛋白(三者均按实际值赋值)相对表达水平作为自变量，结果显示，阴道炎、治疗方法、IFI16、STAT1蛋白、T-bet蛋白的表达均与HPV16/18感染转归有关(P<0.05)。见表3。

表3 HPV16/18感染转归的多因素Logistic回归分析

2.4IFI16、STAT1蛋白、T-bet蛋白及联合检测预测HPV16/18感染转归的ROC曲线分析 IFI16、STAT1蛋白、T-bet蛋白及联合检测预测HPV16/18感染未转阴的AUC分别为0.841、0.729、0.835、0.932，IFI16、STAT1蛋白、T-bet蛋白联合检测预测HPV16/18感染未转阴的AUC最大，三者联合检测的灵敏度为88.00%，特异度为85.00%，见图2。

图2 IFI16、STAT1蛋白、T-bet蛋白及联合检测预测HPV16/18感染未转阴的ROC曲线分析

2.5IFI16、STAT1蛋白、T-bet蛋白高表达与低表达患者转阴率比较 以ROC曲线获得的IFI16、STAT1蛋白、T-bet蛋白最佳截断值(0.91、1.31、0.61)作为分界点，将患者分为IFI16、STAT1蛋白、T-bet蛋白高表达与低表达患者，结果显示，IFI16、STAT1蛋白高表达患者转阴率低于IFI16、STAT1蛋白低表达患者，T-bet蛋白高表达患者转阴率高于T-bet蛋白低表达患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 IFI16、STAT1蛋白、T-bet蛋白高表达与低表达患者转阴率比较[n(%)]

3 讨 论

本研究针对感染高危HPV16/18型感染进行分析，因其高致病性，所有研究对象在阴道镜病理排除已存在宫颈病变后均采取了治疗干预，包括HIFU、LEEP和药物治疗，以促进HPV16/18感染转阴，结果表明，转阴组采取HIFU、LEEP治疗方法的患者占比与采取药物治疗方法的患者占比比较，差异有统计学意义(P<0.05)，提示HIFU、LEEP治疗效果优于药物。

IFI16基因定位于染色体1q23，已被发现在细胞衰老、凋亡、增殖、炎症免疫反应等中具有重要的作用[8]。本研究结果显示，与转阴组比较，未转阴组IFI16蛋白表达明显升高，是HPV16/18感染转归相关影响因素。文献[9]报道在体外细胞实验中，HPV E7通过募集IFI16炎性小体，抑制细胞焦亡，促进HPV自我逃避免疫监视，表明IFI16高表达不利于HPV清除，本研究结果与文献[9]报道结果有相似之处。一方面IFI16蛋白高表达可触发、加重宫颈局部炎性反应，不利于HPV感染的修复，另一方面IFI16蛋白高表达可通过抑制抑癌基因p53表达，为HPV相关宫颈病变的进展创造有益局部微环境。但文献[10]报道在体外观察到了IFI16能通过整合先天免疫和表观遗传，抑制病毒感染，本研究结果与文献[10]报道结果不同，提示体内、体外IFI16作用不同，可能与体内IFI16调控机制更复杂有关，有待后续进一步观察探讨。

STAT1蛋白包含6个结构域，功能复杂，可调控功能性基因和细胞因子基因的表达[11]。本研究结果显示，未转阴组STAT1蛋白高于转阴组，STAT1蛋白表达与HPV16/18感染转归密切相关。上调STAT1蛋白表达，可导致宿主和病毒基因表达发生变化，造成HPV持续感染[12]。WU 等[13]报道，STAT1蛋白表达与HPV 16病毒载量呈正相关。吴思等[14]研究显示，STAT1蛋白表达随宫颈病变等级升高逐渐增加，均表明STAT1蛋白表达升高在HPV感染转归中起到消极作用。STAT1蛋白在HPV16/18感染早期阶段升高是机体对HPV16/18感染的一种应激性反应，具有保护作用，但随着感染时间推进，若HPV16/18未转阴，STAT1蛋白又起到原癌基因作用，参与宫颈癌前病变向癌变的转化[15]。本研究发现，STAT1蛋白高表达患者转阴率低于STAT1蛋白低表达患者，证实STAT1蛋白表达情况会影响HPV16/18感染转归。

T-bet蛋白可通过调控辅助性T细胞1与辅助性T细胞2之间的转换，调节机体免疫功能[16]。本研究发现，未转阴组T-bet蛋白表达低于转阴组，提示T-bet蛋白与HPV16/18感染转归有关，后续的多因素分析亦证实这一结论。在HPV16感染所致宫颈炎大鼠模型中，宫颈局部T-bet蛋白表达降低，而给予相关治疗后，T-bet蛋白表达升高，HPV16感染转阴[17]。陈雪等[18]报道，HPV阳性患者T-bet蛋白相对表达水平低于HPV阴性患者。本研究结论与文献[17-18]报道结果一致。T-bet蛋白通过启动辅助性T细胞1遗传程序在辅助性T细胞1细胞的发育中起重要作用，并且抑制辅助性T细胞2细胞因子的合成，起到增强免疫功能作用，从而影响HPV16/18感染转归。T-bet蛋白高表达患者转阴率高于T-bet蛋白低表达患者，说明T-bet蛋白对HPV16/18感染转阴具有促进作用。T-bet蛋白预测HPV16/18感染未转阴的AUC低于IFI16、STAT1蛋白、T-bet蛋白联合检测的AUC，且三者联合检测的AUC最大，故建议临床三者联合检测对HPV16/18感染转归进行预测。另由于宫颈局部IFI16、STAT1蛋白、T-bet蛋白表达与HPV16/18感染转归有关，所以HPV16/18感染患者检测IFI16、STAT1蛋白、T-bet蛋白表达还能为临床选取合适的治疗方式提供参考，例如检测IFI16、STAT1蛋白、T-bet蛋白表达结果发现，患者转阴可能性较小，则建议患者接受HIFU或LEEP进行治疗；若检测IFI16、STAT1蛋白、T-bet蛋白结果发现，患者转阴可能性较大，若患者自身犹豫不决或经济能力有限，可先选取药物进行治疗，后续加强随访，再决定下一步的干预方法，使患者受益最大化。

综上所述，宫颈局部IFI16、STAT1蛋白、T-bet蛋白表达与HPV16/18感染转归有关，三者联合检测可作为预测HPV16/18感染转归的一个可靠方案，在保证转阴率的同时，又避免过度治疗增加患者负担。