原发性开角型青光眼房水中EPO、Sema3A、TGF-β1与视网膜纤维层厚度、视野缺损的相关性研

王丹 陈云珍 闫楠

原发性开角型青光眼(primary open-angle glaucoma,POAG)是一种常见的视神经退行性疾病,是导致眼盲的重要原因之一,主要表现为视网膜神经纤维层缺损和视野缺损。其发病机制尚不明确,主要与视网膜神经节细胞凋亡导致眼内压增高有关。眼内微循环失调导致视乳头血流灌注不足和局部缺血是引起视神经病变的重要原因[1,2]。促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)是红细胞生成过程中重要的糖蛋白,眼部缺氧是红细胞生成素与其受体结果促进红细胞释放的重要原因;信号素3A(semaphorin3A,Sema3A)是一种多功能蛋白,在视网膜发育、神经细胞轴突形成、血管发生中具有重要作用;转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是一种多功能生长因子,在多种细胞生长、凋亡、修复等过程发挥作用,但三者在POAG患者病情评估的报道较少[3,4]。基于此,本项研究拟以本院156例POAG患者为研究对象,检测不同视野缺损程度患者房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平,分析其水平变化与患者视网膜纤维层厚度及视野缺损的关系,旨在为预防POAG患者病情进展提供指导依据。

资料与方法

一、一般资料

前瞻性病例对照研究。选取本院2019年6月至2020年6月期间收治的156例(156只眼)POAG患者作为观察组,并选取同期进行手术的78例(78只眼)白内障患者作为对照组。对照组纳入标准:(1)白内障患者术后视力校正0.6以上,屈光度±2.50D、试盘比<0.6,双眼试盘差<0.2;(2)无青光眼相关症状(视乳头损害、视网膜神经纤维层损害、视野缺损等);(3)常规视野检测结果正常;(4)无青光眼疾病家族史及其它内眼或视神经疾病。

POAG观察组根据患者视野缺损程度将患者分为A组(视野平均缺损程度≤-6 dB)55例、B组(视野平均缺损程度在-6 dB～-12 dB之间)66例和C组(视野平均缺损程度≥-12 dB)35例。观察组纳入标准:(1)青光眼患者符合全国青光眼学组提出的诊断标准[5],眼压>21 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)、青光眼性视乳头损害和视网膜神经纤维层损害,或青光眼性视野缺损和前房角开放或全部符合即可确诊为POAG[6];(2)初次就诊;(3)无青光眼家族史;(4)患者知情且签署知情同意书。排除标准:(1)合并眼部外伤或内眼手术史者;(2)合并心血管系统或免疫系统疾病者;(3)合并视网膜和神经病变者;(4)无法进行光学相干断层检查者;(5)服用过免疫相关药物者。研究获医院伦理委员会批准。

二、方法

入院时搜集患者性别、年龄、血压、心率等资料,然后进行全面眼科检查,测量眼压、眼轴、前房深度及角膜中央厚度等,然后进行视野检查和相干光层析成像术(optical coherencetomography,OCT)检查。术中取房水标本保存待测。

三、观察指标

1. 一般资料比较:组间分析比较POAG患者和白内障患者性别、年龄、眼轴、眼压、视野平均缺损、杯盘比等一般资料情况。

2.2组患者房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平:于手术中进行房水标本采集,使用一次性无菌注射器于透明角膜缘穿刺进入前房,缓慢抽取房水样本50～100 μl,严格按照无菌操作原则,注入0.5 ml高压灭菌的Eppendorf管中并作标记,置于-80 ℃冰箱避光保存。采用酶联免疫吸附实验法检测房水中EPO水平。取房水样本,用二喹啉酸试剂盒测定蛋白浓度,取20 μl蛋白浓度房水加入聚丙烯酰胺凝胶中,进行电泳。然后置于硝酸纤维素膜,以5%脱脂牛奶室温下封闭硝酸纤维素膜于4 ℃孵育2 h,加入稀释好的一抗,过夜,加入稀释的辣根过氧化物酶二抗,室温孵育2 h。以β-catin作为内参,凝胶成像显影获得Sema3A蛋白条带,以蛋白条带的灰度值计算Sema3A表达量。使用美国R&DSystems公司试剂盒,采用酶联免疫双抗体夹心法检测房水中TGF-β1水平,设置标准曲线,将待测品孔每孔中加入房水样本,并设置2个复孔,于室温下反应2 h,以PBS洗涤5次,每孔加入一抗,于室温孵育1 h,洗涤5次,加入二抗,于室温孵育1 h,清洗反应板,加入底物液,室温避光反应10 min,加入终止液,使用芬兰Thermo公司酶标仪测定波长450 nm处吸光度值。

3.组患者视网膜纤维层厚度及视野平均缺损程度比较:观察组患者于入院就诊时采用全自动视野机进行视野检查,设置为24-2中心视野的阈值检测程序,以SIT A-Fast统计分析并计算视野平均缺损程度,使用红外摄像仪自动监测受检眼的固视状态。白内障患者于术后第2周复查时进行视野检查。使用OCT(ZEISS,德国)进行视网膜纤维层厚度检查,以视乳头为扫描中心,扫描参数为:波长840 mm,横向分辨率15 μm,轴向分辨率5 μm,深度2 mm,直径3.45 mm,长度 12 mm,自动获取视盘周围视网膜纤维层厚度,信号强度40分以上清晰图像为检查结果,检查均由同一名经验丰富的医师完成。然后进行组间分析比较。

4.房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平与视网膜纤维层厚度及视野缺损程度的相关性分析:采用arson相关性分析房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平变化与视网膜纤维层厚度及视野缺损程度的关系。

四、统计学分析方法

结 果

一、 一般资料比较

2组患者性别、年龄、眼轴等资料差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性;而观察组患者眼压、视野平均缺损、杯盘比显著高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 一般资料比较

二、 2组患者房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平比较

观察组患者房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平显著高于对照组,且观察组中B组和C组房水中EPO、GF-β1水平高于A组,组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 2组患者房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平比较

三、 2组患者视网膜纤维层厚度及视野平均缺损程度比较

观察组患者视网膜纤维层厚度显著低于对照组,且观察组中B组和C组视网膜纤维层厚度低于A组,组间比较差异具有统计学意义(P<0.05);观察组患者视野平均缺损程度显著高于对照组,且观察组中B组和C组视野平均缺损程度显著高于A组,组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 2组患者视网膜纤维层厚度及视野平均缺损程度比较

四、房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平与视网膜纤维层厚度及视野缺损的相关性分析

Pearson相关性分析结果显示,房水中EPO水平与视网膜纤维层厚度呈负相关关系(r= -0.348,P<0.05),与视野缺损程度呈正相关关系(r=0.518,P<0.05);房水中Sema3A水平与视网膜纤维层厚度呈负相关关系(r= -0.426,P<0.05),与视野缺损程度呈正相关关系(r=0.629,P<0.05);房水中TGF-β1水平与视网膜纤维层厚度呈负相关关系(r=-0.457,P<0.05),与视野缺损程度呈正相关关系(r=0.532,P<0.05)。见表4。

表4 房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平与视网膜纤维层厚度及视野缺损的相关性分析

讨 论

POAG因早期无明显症状,不易发生,具有较高潜在风险。临床以OCT检查测量视网膜纤维层厚度帮助早期诊断,但对无视野缺损患者存在一定争议,影响其应用[7,8]。寻找可评估POAG患者视网膜纤维层厚度和视野缺损程度的生物学指标,帮助早期诊断及治疗是目前临床重点关注的内容[9,10]。POAG患者房水中EPO、Sema3A、TGF-β1显著升高,且其水平随视网膜纤维层厚度的变薄,视野缺损程度的加重而逐渐升高,可为预防POAG病情进展提供重要参考。

本次研究结果显示:观察组患者眼压、视野平均缺损、杯盘比显著高于对照组(P<0.05),说明POAG的发生与患者眼压、视野缺损及杯盘比有关。究其原因,青光眼主要与视网膜神经节细胞及轴突丢失导致盘沿、视乳头心态凹陷、视网膜纤维层厚度改变,进而导致视野缺损,甚至失明[11,12]。当视网膜神经节细胞丢失30%时视功能损害,随着丢失数量的升高,损害程度加重。视网膜神经节细胞丢失,刺激眼压升高,眼内微循环改变,眼部缺氧导致视神经病变,进而参与青光眼疾病进展[13,14]。并且,观察组患者房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平和视野缺损显著高于对照组,而视网膜纤维层厚度低于对照组,说明POAG患者房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平显著升高,视野缺损程度加重,视网膜纤维层变薄,而随着视野缺损程度的不断加重,视网膜纤维层逐渐变薄,房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平逐渐升高,提示房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平与视网膜纤维层厚度和视野缺损程度密切相关。Pearson相关性分析结果显示,房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平与视网膜纤维层厚度呈负相关关系,与视野缺损程度呈相关关系。上述结果提示:可通过检测POAG患者房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平了解患者视网膜纤维层厚度变化情况及视野缺损程度情况,进而为早期诊断及治疗提供依据。这可能是因为局部缺氧诱导虹膜血管异常新生,纤维血管膜收缩,刺激眼内压升高,导致小梁网粘黏,房水无法正常排出,加重眼压,进而影响视神经[15,16]。EPO是促进血管生成的糖蛋白激素,视网膜损害时EPO可通过刺激红系祖细胞分化、增生,促进神经血管生长,保护患者视网膜神经节细胞免受损伤。局部缺氧时,视乳头血流灌注不足及局部缺血,细胞内过氧化氢含量减少会促进红细胞生成,进而导致EPO水平升高,其水平升高时可促进新生血管生成,致使眼压升高。同时,EPO升高还会引起虹膜组织黏连,影响血流动力学,进而导致眼部微循环失调,导致视野缺损,影响视功能[17,18]。Sema3A对视网膜发育、神经细胞轴突形成、血管发生产生具有较好调控作用,通常在缺血缺氧环境下发挥作用。可通过与受体神经纤毛蛋白1结合介导促血管新生,阻碍视网膜血管重建,同时进一步加重缺氧,还可通过破坏内皮细胞的紧密连接,促进视网膜血管闭塞和缺氧,进而刺激血管异常新生,加重小梁网阻塞,最终促使眼压升高[19,20]。TGF-β1是一种具有多种生物活性的多肽类生长因子,在细胞生长、分化、凋亡及免疫调节、细胞外基质合成等过程发挥重要功能。TGF-β1可通过刺激成纤维细胞的增殖来加固新生血管结构,还可作用于小梁网,导致房水流出减少,进而直接导致眼压升高,参与青光眼进展过程[21]。因此,房水中EPO、Sema3A、TGF-β1可通过调控新生血管生成,并通过促使小梁网细胞凋亡,阻碍房水排出,加重眼压,加剧视野缺损。因此,原发性开角型青光眼患者房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平与视野缺损加重,视网膜纤维层厚度变薄密切相关,可为POAG预防病情进展及治疗提供新方向。

综上所述,POAG患者房水中EPO、Sema3A、TGF-β1显著升高,其水平与患者与视网膜纤维层厚度及视野缺损程度密切相关,检测其水平可帮助患者病情评估,进而为预防POAG病情进展提供重要参考依据,具有较高临床应用价值。