金桂种子休眠类型鉴定及休眠打破方法探讨

焦雪辉 ，史喜兵 ，岳长平 ，申潇潇 ，周小娟 ，孙毅宁

（1.郑州市农林科学研究所，河南 郑州 450005；2.鄢陵县东华种植农民专业合作社，河南 许昌 461200）

种子休眠的现象普遍存在于高等植物中，林木、果树、花卉、农作物等均存在种子休眠现象。引起休眠的原因包括胚外周组织的机械、物理或化学性抑制等外在原因和胚未分化或发育未成熟、代谢抑制物等内在原因[1]。BASKIN等[2]提出了种子休眠分类系统，该系统主要包括物理休眠、形态休眠、生理休眠、复合休眠和形态生理休眠5个种类。

桂花种子存在休眠现象，一般在4月下旬至5月上旬成熟，通常需要经过6个月以上的常温沙藏才会萌芽。前人对桂花种子休眠进行过研究。张义等[3]研究发现，低温层积能够促进桂花种子发芽。赤霉素浸泡与低温层积相结合效果更好，以3000 mg/L赤霉素浸泡2 d和2000 mg/L赤霉素浸泡2 d或4 d，层积60 d效果最好，发芽率可达62.7%。许岳香[4]研究发现，胚乳的机械作用是造成美国桂花（Osmanthus americanus）种子休眠的主要原因。去种壳+赤霉素处理+赤霉素拌沙低温层积对解除美国桂花种子的休眠最为有效，在处理后45 d能使种子的发芽率达到74%。籽银桂的种皮和胚乳中含有抑制发芽的物质，赤霉素与低温层积结合可以解除种子休眠，其中，以1000 mg/L赤霉素浸种，低温层积105 d的发芽率最高，达72.37%[5]。

目前，对桂花种子休眠的研究多集中在休眠打破方法上，其中，休眠打破多以低温层积和赤霉素浸泡为主，而从形态结构及内源物质等方面对休眠特性进行鉴定，根据休眠特性和原因探索打破休眠方法的研究不多。本试验对金桂（Osmanthus fragransvar.thunbergii）种子种壳吸水性及内源抑制物进行了研究，并通过低温沙藏、种壳机械处理、GA3及硝酸镧浸泡等方法对种子进行了休眠打破，旨在揭示金桂种子的休眠类型，总结休眠打破方法，缩短播种育苗周期，为降低繁育成本提供理论支持。

1 材料和方法

1.1 试验材料

2020年5月初，于郑州市农林科学研究所须水试验场采集成熟的金桂果实，去除果肉，洗净晾干，从中挑选大小均匀、饱满、无病虫害的种子，用3%高锰酸钾溶液浸泡20 min，蒸馏水冲洗3次，放置于实验室备用。

试验中GA3购自北京中科起源科技有限公司，硝酸镧购自阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 休眠类型鉴定试验

1.2.1.1 种壳吸水性试验 分别取去壳种子及划口种子（从胚一端开始，用解剖刀向下对称划开种壳，至种子1/2处，露出胚但不损伤胚）各20粒，以完整种子作为对照。种子称量初始质量（G0），放入锥形瓶中，加入30 mL蒸馏水，置于25 ℃恒温环境中，每隔一定时间取出种子用吸水纸吸干表面水分后称质量（Gi），重复3次，直至种子质量不再增加为止。前8 h，每浸泡2 h取一次称质量，之后每隔12～24 h取一次。以净吸水量随时间的变化来表示种子的吸水率（Vi），并绘制吸水曲线。

1.2.1.2 金桂种子内源抑制物对白菜籽发芽的影响 取新鲜的种子，剥开种子并分离种壳和胚乳，分别称取1 g，放入预冷的研钵内研碎，加入80%甲醇溶液20 mL，摇晃均匀，放入5 ℃冰箱恒温浸提24 h，每4 h晃动一次，24 h后过滤，连续浸提3次，将3次滤液合并后倒入旋转蒸发仪，减压蒸干后用蒸馏水冲洗，最后定容到100 mL作为种壳和胚乳浸提液。重复3次。

挑选饱满的白菜籽，用0.5%高锰酸钾溶液消毒，蒸馏水冲洗净后自然风干备用。将培养皿中放入2层滤纸，加入浸提液20 mL，放入白菜籽30粒，培养皿上覆一层保鲜膜，均匀扎孔保证透气，放入25 ℃恒温光照培养箱培养，期间保持滤纸湿润。以蒸馏水培养作为对照。每个处理重复3次。48 h后统计每个培养皿中发芽的白菜籽数量，以发芽长度超过种子直径为标准，计算平均发芽率；72 h后测量根长，记录白菜籽生长情况。

1.2.2 休眠打破试验

1.2.2.1 GA3质量浓度对金桂种子发芽的影响 取划口种子30粒，分别放入质量浓度为1000、2000、3000 mg/L的GA3溶液中浸泡48 h，以蒸馏水浸泡作对照。浸泡后用蒸馏水洗净，放入陶盆中5 ℃低温沙藏处理60 d后取出种子，用3%高锰酸钾溶液浸泡20 min，蒸馏水冲洗3次，放入25 ℃光照培养箱培养，光照16 h、黑暗8 h。每组重复3次，连续5 d不再发芽时试验结束，以发芽长度超过种子直径为标准统计发芽率。

1.2.2.2 硝酸镧质量浓度对金桂种子发芽的影响取划口种子30粒，分别放入质量浓度为10、20、30 mg/L的硝酸镧溶液中浸泡48 h，以蒸馏水浸泡作对照。浸泡后用蒸馏水洗净，放入陶盆中5 ℃低温沙藏处理60 d后取出种子，用3%高锰酸钾溶液浸泡20 min，蒸馏水冲洗3次，放入25 ℃光照培养箱培养，光照16 h、黑暗8 h。每组重复3次，连续5 d不再发芽时试验结束，统计发芽率。

1.2.2.3 种壳处理方式对金桂种子发芽的影响 分别取完整种子、划口种子、去壳种子各30粒，用1000 mg/L GA3溶液浸泡48 h，蒸馏水冲洗干净后，放入陶盆中5 ℃沙藏60 d，取出种子，用3%高锰酸钾溶液浸泡20 min，蒸馏水冲洗3次，放入25 ℃光照培养箱培养，光照16 h、黑暗8 h。每组重复3次，连续5 d不再发芽时试验结束，统计发芽率。

1.2.2.4 低温沙藏时间对金桂种子发芽的影响取划口种子30粒，用1000 mg/L GA3溶液浸泡48 h，蒸馏水冲洗干净后，分别放入陶盆中5 ℃沙藏30、60、90 d，以沙藏0 d作对照。种子沙藏后用3%高锰酸钾溶液浸泡20 min，蒸馏水冲洗3次，放入25 ℃光照培养箱培养，光照16 h、黑暗8 h。每组重复3次，连续5 d不再发芽时试验结束，统计发芽率。

1.2.3 综合因素对金桂种子发芽的影响 在单因素试验基础上，选出单因素中对休眠打破效果较好的处理进行优化，综合几个因素进行种子休眠打破试验（表1）。种子在不同溶液中的浸泡时间均为48 h，消毒、培养、发芽率统计等处理同单因素试验，每处理取30粒种子，重复3次。

表1 多因素处理方法Tab.1 Multifactor treatment method

1.3 数据分析

试验采用Excel进行数据统计，SPSS 23.0进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 金桂种子休眠类型鉴定

金桂种子吸水曲线如图1所示。

图1 金桂种子吸水曲线Fig.1 Water absorption curve of Osmanthus fragrans var. thunbergii seeds

从图1可以看出，去壳种子和划口种子的最终吸水率均显著高于完整种子。完整种子吸水率最终为26.73%，去壳种子的吸水率为37.46%，划口种子的吸水率为35.33%。划口种子和去壳种子前6 h为快速吸水期，吸水率迅速上升，8 h后吸水率减缓，3 d后完整种子吸水达到饱和，6 d后划口种子吸水达到饱和。去壳种子在0～12 h，种子迅速吸水，12～48 h种子吸水率上升速度最快，6 d后吸水达到饱和。由此可以看出，金桂的种壳对种子吸水存在一定的阻碍作用。

由表2可知，培养24 h后，3种培养条件下白菜籽发芽率差异显著，蒸馏水培养24 h后白菜籽发芽率可达到100%，种壳和胚乳浸提液培养的白菜籽发芽率均显著低于对照（P<0.05），且胚乳浸提液培养的白菜籽发芽率显著低于种壳浸提液（P<0.05）。48 h后白菜籽发芽率差异仍然显著，规律与24 h时相同，种壳和胚乳浸提液培养条件下白菜籽发芽率有所升高，胚乳仍然最低，仅为57.78%。48 h后3种培养条件下根长差异显著，蒸馏水培养条件下根长最长，达到23.50 mm，胚乳浸提液培养条件下根长最短，仅为3.47 mm。72 h后 3种培养液对白菜籽根长的影响依然差异显著。蒸馏水培养的白菜籽根长达到47.43 mm，比48 h时增加了23.93 mm；种壳浸提液培养的白菜籽根长也有所增加，胚乳浸提液依然最短，且仅比48 h时增加了0.06 mm。由此可见，种壳和胚乳浸提液对白菜籽的萌发及根的生长有明显的抑制作用，其中，胚乳的抑制作用更明显，说明种 壳及胚乳中可能含有抑制种子发芽的物质。

表2 白菜籽发芽情况Tab.2 Germination of Chinese cabbage seeds

2.2 单因素处理对金桂种子休眠打破的影响

在所有处理中，金桂种子在放入培养箱第2天即开始发芽，培养15 d左右不再有新种子发芽。所有处理对种子开始发芽时间的影响差异不大。

由图2可知，GA3质量浓度为1000、2000 mg/L时，种子的发芽率显著高于GA33000 mg/L，也显著高于对照（P<0.05），1000、2000 mg/L GA3间发芽率差异不显著。其中，GA3质量浓度为1000 mg/L时种子发芽率最高，可达51.11%，而GA3质量浓度为3000 mg/L时种子发芽率仅为15.56%，与对照间差异不显著。可见，高质量浓度的GA3可能对种子发芽有抑制作用。

图2 GA3质量浓度对休眠打破的影响Fig.2 Effect of GA3 mass concentration on dormancy breaking

硝酸镧质量浓度对金桂种子发芽率影响差异显著（P<0.05），3个质量浓度条件下种子发芽率均显著高于对照。其中，硝酸镧30 mg/L时发芽率最高，且显著高于其他2个质量浓度，种子发芽率可达44.44%。硝酸镧质量浓度为20 mg/L时，种子发芽率为37.78%，显著高于质量浓度为10 mg/L时的27.78%（图3）。可见，硝酸镧对种子发芽有促进作用，高质量浓度的硝酸镧对种子发芽促进作用更明显。

图3 硝酸镧质量浓度对休眠打破的影响Fig.3 Effect of lanthanum nitrate mass concentration on dormancy breaking

将金桂种子进行去壳和划口处理后，种子发芽率显著提高，其中，划口种子发芽率最高，达到41.11%，与去壳种子发芽率间差异不显著。完整种子发芽率仅为11.11%，显著低于其他2种处理（图4）。可见，种壳对种子发芽存在一定的机械阻碍。在试验中观察到，去壳种子尽管完全摆脱了种壳的机械阻碍，但其发芽率却并非是最高的，可能是因为种子完全去壳后，胚乳直接暴露在空气中，更容易被细菌污染，从而导致发芽率降低。

图4 种子处理方式对休眠打破的影响Fig.4 Effect of seed treatment on dormancy breaking

在不同贮藏时间对金桂种子发芽影响试验中，贮藏90 d后种子的发芽率最高，达到52.22%，与贮藏60 d间差异不显著，但二者均显著高于贮藏30 d和对照的发芽率（P<0.05）。贮藏30 d后种子发芽率为16.67%，而对照的种子发芽率仅为5.56%（图5）。可见，低温贮藏时间对种子发芽影响显著，贮藏时间越长，种子发芽率越高。

图5 低温沙藏时间对休眠打破的影响Fig.5 Effect of low temperature sand storage time on dormancy breaking

从图2～5还可以发现，低温沙藏时间对种子休眠打破的影响最显著，低温沙藏90 d与未经过低温沙藏的种子萌发率相差46.66百分点，而种壳处理方式中划口种子与完整种子萌发率相差30百分点，可见，生理后熟可能是造成金桂种子休眠的主要原因，而种壳的机械阻碍可能是造成种子休眠的次要原因。

2.3 多因素处理对金桂种子休眠打破的影响

因单因素处理中金桂种子发芽率最高也仅能达到52.22%（图5），为进一步提高种子发芽率，对单因素试验进行优化，综合几个因素对金桂种子休眠打破进行试验。从图6可以看出，所有处理条件下种子发芽率均显著高于对照，其中，处理1、4、5、7条件下种子发芽率均在80%以上。处理5条件下种子萌发率最高，可达87.78%，与处理1、4间差异不显著，说明在其他因素一致的情况下，硝酸镧质量浓度分别为40、50 mg/L时，与30 mg/L时对发芽率影响无显著差异。在同样浓度下，同时使用GA3和硝酸镧处理的发芽率要远远高于单独使用其中一种时的发芽率。处理1条件下种子发芽率显著高于处理2、3，而处理2、3之间差异不显著，说明GA3质量浓度为1000 mg/L时休眠打破效果要远远好于低质量浓度。处理6条件下发芽率要显著低于处理1，说明相同条件下划口种子休眠打破效果要显著好于去壳种子。处理1条件下种子发芽率与处理7间差异不显著，但二者均显著高于处理8，说明5 ℃沙藏60、50 d对种子发芽率影响差异不大，但显著高于40 d时发芽率，由此可见，金桂种子在低温沙藏50 d后可能已经解除休眠了。

图6 多因素处理对种子休眠打破的影响Fig.6 Effect of multifactor treatment on seed dormancy breaking

3 结论与讨论

造成种子休眠的因素很多，主要包括环境因素，如温度[6-7]、光照[8]等，以及种子内源因素，如种皮结构[9]、内源抑制物质[10]、种胚发育不成熟[11]、胚乳的机械阻隔[12-13]等。打破种子休眠常用的方法有种皮去除、层积处理、外源激素及化学试剂处理等，其中，外源激素打破种子休眠具有高效、便捷等优点[14]。杨秀莲等[15]对紫梗籽银桂种子休眠原因进行了初步探讨，认为种皮和种仁中的抑制物质可能是引起种子休眠的原因，而坚硬的外种皮并不是引起休眠的原因。本研究中对金桂种壳的吸水性和内源抑制物进行了初步研究，结果发现，去掉坚硬的种壳或者在种壳上划口处理，最终的吸水率要高于完整种子，说明金桂种子的种壳对吸水性存在一定的阻碍作用。但金桂种子的种壳比较薄，即使完整种子吸水速率也并非特别低，可以保证种子萌发对水分的需求，因此，种壳的机械阻碍并不是造成金桂种子休眠的主要原因。

种子的内源抑制物质种类具有多样性，主要包括辛酸、棕榈酸[16-17]、酚类、脂类、酮类[18]等，这些物质对种子萌发都有抑制作用，但作用方式和机制各不相同。施婷婷等[19]对紫梗籽银桂果皮、种实内源抑制物进行了提取和鉴定，发现存在多种抑制物质，主要为脂肪酸类物质。本研究中利用白菜籽萌发试验，间接证明了金桂种子中也存在抑制物质，主要抑制白菜籽根的发芽和伸长，且胚乳的抑制作用要比种壳明显。不过，本研究所得出的抑制作用是针对白菜籽的，且浸提液未进行稀释，浓度较高，金桂种子的内源抑制物质对其自身种子萌发是否存在抑制作用，以及抑制物浓度达到多少才会对其种子萌发产生抑制作用，还需要进一步论证。

种子由抑制物质起主要作用转向促进物质占主导地位，是解除休眠的决定性因素[20]。休眠解除过程受多种激素控制。ABA含量与GA3/ABA值可能是解除休眠的关键因素[21]。种子经过层积处理后，可以减少萌发抑制物，调控种子内部激素水平向利于休眠解除的方向发展，同时能够增加种皮的透性，促进种子生理后熟。杨秀莲等[5]研究认为，赤霉素结合低温层积可以有效解除桂花种子的休眠。袁王俊等[22]则研究认为，使用赤霉素和3个月层积处理不能促进桂花种子萌发，但层积3个月后进行离体培养，再在培养基中加入NAA和BA可以打破休眠，促进桂花种子萌发。本研究分别对赤霉素和低温层积时间进行了梯度试验，结果表明，GA3质量浓度为1000、2000 mg/L均可以提高金桂种子发芽率，且显著高于对照和GA3质量浓度为3000 mg/L时的种子发芽率，这与杨秀莲等[15]研究结论基本一致。低温层积60、90 d均可以显著提高种子发芽率，且显著高于对照和低温层积30 d时的发芽率，这与杨秀莲等[15]研究结论不一致。一方面可能是试验材料本身的差异，另一方面可能是因为层积温度和层积容器的差异，杨秀莲等[15]试验中所用材料为紫梗籽银桂，在塑料棚中2～4 ℃低温层积，而本研究中用的是金桂，在陶盆中5 ℃低温层积。通过试验还发现，GA3和低温层积处理对种子发芽的促进作用要显著强于种壳机械处理，因此，可以断定金桂种子应该属于复合休眠类型，同时存在生理休眠与物理休眠。生理后熟是导致桂花种子休眠的主要因素，而种壳的机械阻碍只是次要因素。

许多研究和综述[23]已经指出，稀土元素可促进植物生长发育，提高作物产量，提高作物淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、过氧化物酶、硝酸还原酶和酯酶等活性及土壤酶的活性，促进新陈代谢，说明稀土是一种新型的植物生长调节剂。镧是17种稀土元素中最重要和最活泼的元素[24]。本研究利用硝酸镧对金桂种子进行休眠打破试验，发现其对金桂种子休眠的打破有促进作用，可能是因为稀土元素镧对种子萌发的促进作用，镧能够提高种子或种芽中与生长发育相关的酶活性，从而加快大分子物质的代谢，提供种子、种芽萌发所需能量和养分，因此，促进了种子、种芽的萌发。而将硝酸镧与赤霉素混合，同时结合低温层积和种壳机械处理，可以进一步提早解除休眠，提高种子发芽率。GA31000 mg/L+硝酸镧50 mg/L+5 ℃沙藏60 d+种子划口处理组合对金桂种子休眠打破效果最好。