CO2加富条件下胡萝卜光合通路及差异基因表达分析

宋甜月，刘 伟，宋红霞

（山西农业大学 园艺学院，山西 太谷 030801）

胡萝卜（Daucus carotaL.）又称“长寿菜”“土人参”“金笋”，原产于中亚细亚一带，元末时传入我国，在全国各地广泛栽培[1]。胡萝卜具有很高的营养价值，富含维生素C、类胡萝卜素和人体必需的酶等，胡萝卜素能够在体内转化为维生素A，不仅能保护视力，还能保证人体生长发育需要，增强免疫力[2-3]。近年来，设施农业发展迅速，但是温室、大棚低温季节为保温其内部相对封闭，导致CO2亏缺，影响作物的光合效率[4]。

CO2是植物光合作用的原料[5]，是光合作用能够进行的物质基础之一，其浓度变化直接影响光合能力的大小。CO2加富能提高植物光捕获系统活性，促进光合电子传递，提高植物光合速率，增加干物质积累，促进植物的生长发育，提高作物品质，因此，设施内增施CO2是促进植物生长发育和光合作用的重要途径之一[6-7]。光合作用是生物界极其重要的反应，可分为3部分：光能吸收传递与转换、电子传递和光合磷酸化、碳同化。光系统Ⅱ（Photosystem Ⅱ，PSⅡ）复合体、光系统Ⅰ（Photosystem Ⅰ，PSⅠ）复合体、细胞色素b6f（Cytb6f复合体）和ATP合酶复合体是主要的光合作用进行的膜蛋白复合体[8-10]，Cytf是细胞色素b6f复合体的组分之一，参与真核生物光合电子传递过程，连接PSⅡ和PSⅠ的电子流，在光合作用中起重要作用[11]。研究表明，CO2浓度的高低调控参与光反应的基因表达，进而影响植物的生长发育[12]，增施CO2能显著促进作物幼苗的生长，提高壮苗指数，对作物的株高、叶片数、根冠比、干质量、鲜质量都有增加的效果[13]。任宏芳等[14]研究发现，CO2浓度升高显著增加谷子的株高、穗长、叶质量、茎质量、穗质量和地上部生物量，且使谷子产量增加28.7%。

目前，关于CO2加富对植物的影响主要集中在生理特性方面的研究[15-16]，在光合通路及差异基因分析上的相关研究较少。本试验以橙色胡萝卜为材料，通过转录组测序技术，研究CO2加富对胡萝卜光合通路及相关基因的影响，旨在为合理增施CO2促进胡萝卜生长发育提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试橙色胡萝卜为山西农业大学选育的甜红1号的母本。其肉质根为圆锥形，肉质根内芯柱比较细嫩，表皮光亮，生育期为110～120 d，适应性强。

1.2 试验方法

试验于2019年9—12月在山西农业大学园艺站的日光温室中进行。9月29日进行小高垄播种，垄宽40 cm，垄间距50 cm，小区面积为5 m2。

1.2.1 试验设计 在日光温室中分别设置富碳区（FC，CO2浓度为（800±50）μmol/mol）和对照 区（CK，自然环境），其中，富碳区使用CO2自动释放系统的装置，以CO2钢瓶为气源。10月31日开始晴天9：00—11：00释放，雪天和雨天不释放，其余均为常规操作。

1.2.2 产量指标测定 收获期分别统计富碳区和对照区的总生物学产量、地上部鲜质量和地下部鲜质量，并计算小区产量，折合公顷产量。

1.2.3 取样及转录组测序 富碳处理61 d（12月28日）后，于晴天10：00取样，分别从自然环境和富碳环境选取3株长势相同、生长健壮的植株，选取第4片功能叶混合取样，每个样品约0.1 g，3次生物学重复。取样后用液氮冷冻保存，用于RNA的提取及表达谱的测序。总RNA的提取和测序工作由北京百迈克公司完成。测序步骤、表达量分析、功能注释、代谢途径的分析方法同文献[17]。

1.2.4 KEGG代谢途径分析 首先，通过测序获得原始测序数据，然后进行数据的质量评估，包括GC content和99.9%碱基识别精度等，然后对富碳处理后的差异基因进行KEGG注释，再进行KEGG代谢途径分析。

1.2.5 实时荧光定量PCR分析 采用基因特异性引物进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）。使用Primer 3.0软件设计引物序列（表1），对gene33346、gene33340和gene33386等3个光合相关基因进行实时荧光定量PCR验证，反应体系为（25 μL）：12.5 μL SYBR、2 μL引 物、2 μL cDNA和8.5 μL ddH2O；反应程序为：95 ℃ 10 min，94 ℃ 15 s，60 ℃1 min，循环40次。

表1 光合相关基因qRT-PCR的引物序列Tab.1 Primer sequence for qRT-PCR of photosynthesis-related genes

1.3 数据分析

试验数据采用Excel 2010和SPSS 20.0进行整理和分析。

2 结果与分析

2.1 CO2加富环境对胡萝卜产量的影响

从表2可以看出，CO2加富后，其总生物学产量、地上部质量、地下部质量均显著高于对照区（P<0.05），分别较对照增加了39.02%、80.25%、26.68%。富碳处理和对照处理的胡萝卜地下部鲜质量均大于地上部鲜质量；富碳区的单根质量达到了170 g以上，增幅明显，增施CO2后小区净产量有所增加，增产效果明显，折合公顷产量高达42688.76 kg，较对照区增产36.56%。

表2 CO2加富对胡萝卜产量的影响Tab.2 The effect of CO2 enrichment on the yield of carrot

2.2 测序结果质量评估

对6个样品CK-1、CK-2、CK-3、FC-1、FC-2、FC-3进行转录组分析，共获得41.21 Gb高质量测序数据。将原始数据进行统计分析，结果如表3所示，CK-1、CK-2、CK-3、FC-1、FC-2、FC-3这6个基因文库分别获得Clean reads数分别为26650192、26920393、25945139、22204974、24809680、21642183条；Clean bases总碱基分别为7957707794、8037639700、7737059862、6624198608、7401073402、6455939670个；GC Content分别占总碱基数的45.27%、45.39%、45.31%、45.26%、45.05%、45.42%，说明测序中G和C、A和T含量相当，碱基类型没有分离现象，测序过程较稳定。对照处理的各样品Q30碱基百分比分别为95.57%、95.70%、95.57%，CO2加富处理的各样品Q30碱基百分比分别为95.81%、95.24%、95.74%，均大于95.24%，说明测序结果较为准确，可以用于后续转录组测序分析。

表3 样品测序数据评估统计Tab.3 Evaluation statistics of sample sequencing data

2.3 KEGG显著性分析

如表4所示，以P-value≤1.5为标准筛选差异基因KEGG的代谢通路，筛选到6条差异基因显著富集的代谢通路，分别为光合通路（ko00195）、植物激素信号转导通路（ko04075）、α-亚麻酸新陈代谢（ko00592）、类胡萝卜素生物合成（ko00906）、亚油酸代谢（ko00591）、氧化磷酸化（ko00190）。其中，光合通路（Photosynthesis）为第1显著富集通路，其次是植物激素信号转导通路（Plant hormone signal transduction）和α-亚麻酸新陈代谢通路（alpha-Linolenic acid metabolism），KEGG通路分析结果说明，CO2加富首先对光合、激素、α-亚麻酸和类胡萝卜素生物合成产生了显著影响。

表4 差异表达基因KEGG富集结果Tab.4 KEGG enrichment results of differentially expressed genes

光合作用是将光能转化为化学能的过程，分为光能吸收传递与转换、电子传递和光合磷酸化、碳同化。光合膜上的色素蛋白复合物按照功能通常分为：光系统Ⅱ（PSⅡ）、光系统Ⅰ（PSⅠ）、Cytb6f复合物及ATP合成酶复合物，在这4个蛋白复合体共同参与下，光合作用中的光反应完成了电子从H2O到NADP+的传递过程，并产生ATP和释放出O2。以PC值≥2为基因显著表达，图1（响应CO2加富的植物光合通路（KO00195））中标红基因表示表达量上调，富碳条件促进了光合电子传递和光合磷酸化过程以及相关酶和蛋白的合成，从而使得光系统Ⅰ相关基因（psaA和psaB与色素结合）、光系统Ⅱ相关基因（psbD、psbC、psbB、psbH、psbZ控制PSⅡ有关蛋白合成）、Cytb6f蛋白复合体（是连接2个光系统的电子传递体）相关基因（petB、petA）、ATP合成酶相关基因（gene33327）表达量上调。

图1 植物光合通路Fig.1 Plant photosynthetic pathway

2.4 光合相关差异表达基因分析

对比富碳区和对照区下的胡萝卜叶片转录组数据，发现富碳区下与光合相关的差异表达的基因有11个，参与反应的酶涉及10种。如表5所示，通过与拟南芥同源基因对比分析，其中gene33346和gene33347的编码基因分别为psaB和psaA，psaB和psaA是PSⅠ光反应中心的基本多肽结构，psaA控制合成的亚基PsaA功能是捕光，psaB控制的亚基PsaB功能是电荷分离、光保护、电荷稳定，叶绿素和β-胡萝卜素都与它们结合；gene33382、gene33314、gene33340、gene33339、gene33385和gene23768均为PSⅡ核心复合体的组成蛋白，参与放氧过程，其编码基因分别为psbB、psbA、psbC、psbD、psbH、psbB，PSⅡ结合许多色素分子，包含叶绿素、β-胡萝卜素和叶黄素。psbB、psbC是核心天线，psbA、psbD是反应中心蛋白。psbH是细胞色素b559的亚基，其功能未知。gene33366和gene33386均为细胞色素b6f（Cytb6f复合体），其编码基因分别为petA、petB。gene33327为ATP合酶跨膜的CF0单位的亚基，负责组织和稳定CF0的结构。这11个基因在CO2加富条件下均上调表达，说明CO2加富可能均促进了胡萝卜的光合作用。

表5 CO2加富条件下胡萝卜光合相关基因分析Tab.5 Analysis of carrot photosynthesis-related genes under CO2 enrichment

gene33346、gene33340和gene33386这3个基因分别代表光系统Ⅰ、光系统Ⅱ和细胞色素b6的相关基因，具有一定的代表性。所以，选取这3个光合相关基因进行RT-qPCR差异表达性分析，同时与转录组数据中的FPKM值进行对比，试验结果表明（图2），富碳处理的gene33346、gene33340和gene33386这3个基因的相对表达水平均极显著高于对照处理（P<0.01），且其相对表达量与相应的FPKM值趋势一致，说明转录组测序结果是准确的，CO2富集影响基因表达，从而推测这些基因可能参与光合作用。

图2 RT-qPCR验证Fig.2 RT-qPCR validation

3 结论与讨论

近年来，大气CO2浓度逐渐升高，将会对植物生长发育及生态环境产生影响；而光合作用是植物利用光，以CO2和水为原料，合成碳水化合物的过程[18]。合理增高CO2浓度，可以为光合过程提供充足的原料，增强光合过程中对CO2的固定能力，提高光合色素和叶绿素含量，提高植物的光能利用率，促进光合电子传递，从而提高光合作用，最终达到增产的目的。本研究结果表明，增施CO2后胡萝卜的总生物学产量、地上部质量、地下部质量以及折合公顷产量均高于未施CO2的对照处理，且较对照处理增产36.56%，这与LI等[19]在板蓝根的研究（增产36.8%）和刘月炎等[20]在虎耳草的研究（增产23.45%）结果相似。而关于该过程的分子响应机制如何，ZHANG等[21]揭示了当CO2浓度升高后，在沙棘中GO功能主要富集在光合系统Ⅰ、光合作用和叶绿体类囊体膜中；赵静[22]通过分析比较自然和富碳条件下草莓叶片的转录组数据，推测与光合有关的差异表达基因共有15个，其中上调表达基因有10个。本试验中，富碳条件下，光合通路为第1显著富集的通路，光合相关基因表达上调，这可能是由于富碳条件促进了光合电子的传递及相关酶的合成。

研究表明，银杏叶光合作用基因ESTs为97条，与光反应相关的基因主要有PSⅡ捕光叶绿素a/b结合蛋白、PSⅠ捕光叶绿素a/b结合蛋白、PSⅠ反应中心亚单位、铁硫蛋白、铁氧蛋白还原酶、ATP合成酶等[23]。psaA或psaB基因的失活都会导致PSⅠ复合物在类囊体中缺失，表明psaA或psaB不能单独形成二聚体，而psaA-psaB异二聚体的存在是整个PSⅠ复合物组装所必需的[24]。本试验中，通过与拟南芥同源基因对比分析，发现gene33346和gene33347的编码基因分别为psaB和psaA，其在CO2加富条件下均上调表达，表明富碳条件下促进了PSⅠ复合物的合成。核心天线CP47和CP43分别是由叶绿体psbB和psbC基因编码的47 ku和43 ku蛋白结合叶绿素a所构成的蛋白复合物[25]。gene33314的编码基因为psbA，psbA基因编码光系统Ⅱ的D1蛋白，在光化学反应中心负责电荷分离和电子转移[26]，而这在其中发挥着重要作用。gene33366和gene33386均为细胞色素b6f（Cytb6f复合体），是光合电子传递链中3个重要的膜蛋白复合体之一，位于光系统Ⅱ和系统Ⅰ之间，介导2个光系统之间的电子传递，同时作为质子泵跨膜转运质子，为ATP合成提供能量[27]。本试验中，CO2处理的gene33386的表达量显著高于对照，这可能是因为gene33386促进了2个光系统之间的电子传递。以上结果表明，CO2加富处理可积极调控这些基因的表达，促进胡萝卜光合作用。

综上所述，本研究共获得41.21 Gb Clean data，各样品Q30碱基百分比均不小于95.24%。KEGG分析表明，差异表达基因显著富集的第1条通路为光合通路，通过与拟南芥同源基因对比分析，发现富碳条件下11个光合相关基因表达上调，这些基因涉及色素合成、电子传递、ATP合成、有关酶的合成等，其中gene33346、gene33340和gene33386这3个光合相关基因的相对表达量与其FPKM值趋势一致，对进一步研究CO2施肥对胡萝卜光合作用的分子机制研究具有重要意义。