山西省屠宰生猪肺脏细菌的分离及耐药性检测

谭仕明，张 甜，石玉节，王 晨，高 宇，程 宇，王照煌，卢 旺，王 莹，武星辰，马海利

（山西农业大学 动物医学学院，山西 太谷 030801）

随着我国畜牧经济的发展，生猪养殖模式从传 统的散养逐步向规模化、集约化的工厂式转变。伴随集约化养殖出现了一系列传染病，特别是由猪呼吸系统疾病引起的猪群发病率和死亡率逐年上升，影响了规模化养殖的经济效益[1-2]。引起猪呼吸系统疾病的原因主要有细菌感染、病毒感染、寄生虫感染，其中细菌性病原主要包括放线杆菌、链球菌、巴氏杆菌和支原体[3]。殷松[4]从四川部分地区采集具有典型猪呼吸系统疾病的样品进行检测，结果检测到链球菌、巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌、放线杆菌和李氏杆菌感染。梁娟[5]运用建立的猪呼吸系统病原菌五重PCR检测方法对临床样品进行检测，结果发现，猪呼吸系统普遍存在单一或混合病原菌感染。李进福[6]从河南省隐性感染的猪病变肺脏分离到大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、葡萄球菌、芽孢杆菌和链球菌。张小华等[7]采集镇江地区不同养猪场粪便样品进行病原菌鉴定，结果发现，猪群生活的环境中存在致病性大肠杆菌、巴氏杆菌和葡萄球菌。然而，由于各地区气候环境不同，细菌感染种类存在差异，同时，不同地区抗菌药物的使用习惯和剂量不同[8]，也造成细菌耐药和多重耐药的现象频发[9-10]，甚至导致超级细菌的产生[11-12]。

为全面了解山西省生猪肺脏组织中细菌的分布和耐药情况，本研究于2019年从山西省11个地市20个屠宰场收集521份生猪肺脏样本，并进行细菌分离鉴定和药敏试验，旨在为山西省规模化养猪场防控细菌性呼吸系统疾病、合理用药和完善猪源细菌感染及耐药谱临床数据提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 样品来源

样品采集点分布如图1所示。

图1 山西省样品采集点Fig.1 Sampling locations in Shanxi province

于2019年6—7月从山西省11个地市的20个屠宰场采集521份猪肺脏组织（图1），其中，北部地区（包括大同市、朔州市、忻州市）131份，中部地区（包括阳泉市、太原市、吕梁市、晋中市）181份，南部地区（包括长治市、临汾市、晋城市、运城市）209份。

1.2 主要试剂

营养琼脂、麦康凯琼脂、营养肉汤、MH培养基、红色荧光核酸染料、50×TAE缓冲液，均购自北京索莱宝科技有限公司；2×Taq PCR MasterMix购自北京全式金生物科技有限公司；DL2000 Marker购自青岛赛奥生物科技有限公司；氨苄西林、庆大霉素、克林霉素、复方新诺明、红霉素、青霉素G、头孢他啶、四环素、多黏菌素B、环丙沙星药敏纸片，均购自杭州滨和微生物试剂有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 细菌分离培养 用灼烧过的剪刀烙烫肺组织表面并剪开，用无菌接种环伸入切口内，蘸取组织液（可重复多次），分别在营养琼脂、麦康凯琼脂、血液琼脂培养基上分区划线，置于37 ℃恒温培养箱内培养，24 h后观察并记录菌落形态，挑取单菌落进行革兰氏染色和纯化培养。

1.3.2 细菌的PCR鉴定 以提取的菌液DNA为模板，选用细菌16S rRNA基因通用引物[13]（27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，引 物 合 成于上海生工生物工程有限公司）进行PCR反应。PCR反应体系（20.0 μL）为：2×TagPCR Master Mix 10.0 μL，菌 液DNA模 板3.0 μL，上 游 引 物1.0 μL，下 游 引 物1.0 μL，无 菌ddH2O 5.0 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃终延伸10 min。

PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离，将目的条带切胶纯化后送上海生工生物工程公司测序，测序结果上传至NCBI进行比对，以确定菌种。

1.3.3 药敏试验 采用K-B[14]法进行药敏试验。用无菌棉签蘸取菌液，接种至MH平板，静置5 min，将药敏纸片贴在平板表面，37 ℃倒置培养16～24 h，量取抑菌圈的直径，并记录。依据《抗菌药物敏感性试验的技术要求（WS/T 639—2018）》[15]进行耐药（R）、中度敏感（I）、敏感（S）判断。

1.3.4 气温记录 收集山西省气象局公布的2019年气温数据，包括各季节的日平均气温、日最低气温和日最高气温。

1.4 数据分析

采用Excel 2016进行数据统计，使用GraphPad Prism 9对4种主要细菌的耐药率和山西不同地区细菌耐药性进行差异性分析。

2 结果与分析

2.1 细菌分离鉴定结果

从521份生猪肺脏样品中共分离到133株细菌，其中，革兰阴性菌（G-）105株，占总数的78.9%；革兰阳性菌（G+）28株，占总数的21.1%。经16S rRNA基因通用引物扩增（图2）、测序并上传至NCBI数据库比对分析，进一步将133株细菌鉴定为18个菌种。将105株革兰阴性菌（G-）鉴定为12种细菌，分别为大肠埃希菌（Escherichia coli）34株、不动杆菌（Acinetobacter）30株、气单胞菌（Aeromonas）10株、肠杆菌（Enteric bacilli）9株、从毛单胞菌（Comanonas）9株、巴氏杆菌（Pasteurella）3株、克雷伯氏菌（Klebsiella）3株、变形杆菌（Proteus）2株、希瓦氏菌（Shewanella）2株、莫拉菌（Moraxella）1株、威克斯菌（Weeksella）1株和爱德华菌（Edwardsiella）1株；将28株革兰阳性菌（G+）鉴定为6种细菌，分别 为 葡 萄 球 菌（Staphylococci）11株、罗 氏 菌（Rosella）7株、链球菌（Streptococci）5株、漫游球菌（Roaming cocci）3株、微球菌（Micrococcus）和肠球菌（Enterococcus）各1株。其中，检出率最高的4种细菌依次为大肠埃希菌（Escherichia coli）、不动杆菌（Acinetobacter）、气单胞菌（Aeromonas）、葡萄球菌（Staphylococci），检出率分别为25.6%、22.6%、8.3%、7.5%。

图2 部分细菌PCR扩增产物电泳结果Fig.2 Electrophoresis results of PCR amplification products of some bacteria

由表1可知，不同地区检出的优势菌株不同，其中，山西北部地区131份肺组织中分离出50株细菌，检出率为38.2%，主要为大肠埃希菌（Escherichia coli），占该地区分离细菌数的40.0%；山西中部地区181份肺组织中分离出44株细菌，检出率为24.3%，主要为大肠埃希菌（Escherichia coli）和葡萄球菌（Staphylococci），各占该地区分离细菌数的22.7%和20.5%；山西南部地区209份肺组织中分离出39株细菌，检出率为18.7%，主要为不动杆菌（Acinetobacter），占该地区分离细菌数的41.0%。

表1 细菌分离结果Tab.1 Bacterial isolation results

2.2 耐药性检测结果

2.2.1 4种主要细菌的耐药性检测结果 4种主要分离菌的药敏试验结果显示（图3），34株大肠埃希菌（Escherichia coli）对复方新诺明、青霉素G以及四环素耐药性强，耐药率分别为56.0%、53.0%、47.0%，对头孢他啶、庆大霉素、多黏菌素B和环丙沙星较为敏感；30株不动杆菌（Acinetobacter）对复方新诺明的耐药率为50.0%，对庆大霉素、环丙沙星、头孢他啶较为敏感；11株葡萄球菌对所选的药物都较敏感；10株气单胞菌（Aeromonas）对青霉素G的耐药率高达80.0%，对庆大霉素和环丙沙星有较高的敏感性。

图3 4种分离细菌的耐药率分析Fig.3 Drug resistance rates analysis of four different bacteria isolated

2.2.2 4种主要细菌多重耐药分析 对分离的4种主要菌株的耐药性结果进行多重耐药分析，结果如表2所示。

表2 4种菌株多重耐药结果Tab.2 Results of multiple drug resistances of four bacterial strains

由表2可知，34株大肠埃希菌（Escherichia coli） 中有24株表现为多重耐药性，其中，2株为6重耐药、3株为5重耐药、5株为4重耐药、7株为3重耐药、7株为2重耐药，占比分别为5.88%、8.82%、14.71%、20.59%和20.59%；30株不动杆菌（Acinetobacter）中有12株菌表现为多重耐药，其中，1株为7重耐药、2株为5重耐药、3株为4重耐药、3株为3重耐药、3株为2重耐药，占比分别为3.33%、6.67%、10.00%、10.00%和10.00%；11株葡萄球菌中有4株表现为多重耐药，5重以上耐药的有2株；10株气单胞菌中有8株表现为多重耐药，其中主要为4重耐药和2重耐药，占比分别为30.00%、40.00%。

2.2.3 不同地区分离菌株的耐药性分析 对山西省不同地区分离细菌的耐药性进行分析可知（图4），不同地区分离细菌的耐药率不同，山西北部地区分离细菌的耐药率普遍高于山西中部和南部地区。北部地区分离细菌对青霉素G、复方新诺明和氨苄西林的耐药率较高，分别为44.0%、42.0%和26.0%，高于该地区分离的细菌对其他药物的耐药率；中部地区分离细菌对复方新诺明、青霉素G、四环素和多黏菌素B的耐药率较高，分别为25.0%、15.9%、13.6%和13.6%，高于该地区分离的细菌对其他药物的耐药率；南部地区分离细菌对复方新诺明、青霉素G和环丙沙星的耐药率较高，分别为23.1%、12.8%和12.8%，显著高于该地区分离的细菌对其他药物的耐药率（P<0.05）。

图4 山西省不同地区细菌耐药性分析结果Fig.4 Analysis results of bacterial drug resistance in dif⁃ferent areas in Shanxi province

2.3 山西省平均气温

根据山西省气象局公布的2019年全省各个地区的气温数据，对各个季度的平均气温进行分析可知（表3），山西省北部全年平均气温比中部和南部的全年平均气温低，由北向南呈上升趋势，而北部地区的细菌感染率高于中部地区和南部地区的细菌感染率，与各地区平均气温呈负相关。

表3 2019年山西省各地区平均气温Tab.3 The average temperature in various areas in Shanxi province in 2019

3 结论与讨论

在养猪业中，细菌感染可引起猪呼吸系统和消化系统疾病，严重影响猪群健康。长期以来，为了提高猪群生产性能和出栏率，大量使用抗生素导致了耐药细菌、多重耐药细菌的产生，甚至出现超级细菌，严重威胁着人类健康。同时，细菌耐药性是不可逆的[16]，耐药菌的产生严重危害了食品安全[17-18]。在本研究采集的521份猪肺脏组织中，共分离到133株细菌。其中，从山西北部地区采集和分离到50株细菌，检出率为38.2%；从山西中部地区采集和分离出44株细菌，检出率为24.3%；从山西南部地区采集和分离出39株细菌，检出率为18.7%，表明从山西北部地区到南部地区，猪肺脏细菌感染率逐渐降低，这可能与山西省南北部气候差异有关。由2019年山西省气温变化可知，全年山西北部地区的平均气温比中部地区和南部地区低，而低温环境下猪群易造成呼吸道黏膜损伤，引起肺部疾患。雒月云等[19]研究表明，冬季是细菌气溶胶暴露风险最高的季节，低温环境有利于延长细菌在外界环境中生存时限，并形成细菌气溶胶，使得细菌在猪群之间传播，增加了感染的风险。

不同地区检出的优势菌株不同。其中，山西北部地区以大肠埃希菌为主，中部地区以大肠埃希菌和葡萄球菌为主，南部地区以不动杆菌为主。有研究表明，动物机体细菌感染的种类与环境中存在的优势菌群具有一定的相关性[20]，说明山西省不同地区养猪环境中存在不同的优势菌群，当猪呼吸道黏膜损伤后，易引起环境优势细菌感染。

对分离率最高的4种细菌大肠埃希菌（Escherichia coli）、不动杆菌（Acinetobacter）、气单胞菌（Aeromonas）以及葡萄球菌（Staphylococci））进行药敏试验，并进行多重耐药性分析后发现，34株大肠埃希菌（Escherichia coli）对复方新诺明、青霉素G以及四环素耐药性较高，最高可表现为6重耐药，主要表现为3重耐药和2重耐药。沈鹏程等[21]2019年对江苏地区分离的231株牛源大肠埃希菌进行耐药分析，发现45.0%细菌对四环素耐药，44.1%的细菌对复方新诺明耐药，表明从江苏和山西两地分离的大肠埃希菌的耐药性相似。30株猪源不动杆菌（Acinetobacter）对复方新诺明的耐药率为50.0%，对庆大霉素、环丙沙星、头孢他啶较为敏感，最高表现为7重耐药，其中表现为4重耐药、3重耐药和2重耐药菌株各占10.0%，与奉鉴金等[22]在2018年分离到的牛源不动杆菌耐磺胺类药物结果一致。本研究分离出的11株葡萄球菌对所有药物都有较高的敏感性，与赵静雯等[23]在2022年分离到的葡萄球菌对庆大霉素、四环素等药物敏感性一致。本研究分离出的10株气单胞菌对青霉素G的耐药率高达80.0%，对庆大霉素和环丙沙星有较高的敏感性，与刘长宇等[24]在2020年分离到的气单胞菌对青霉素同样有较高的耐药性结果相似，推测不同地区分离的同种菌株产生的耐药机制存在一定的相似性。

山西省不同地区分离细菌的耐药率不同，北部地区细菌耐药率普遍高于中南部地区。本研究发现，山西各地区分离的细菌对青霉素G、复方新诺明都具有较高的耐药性，这可能与山西省生猪养殖过程的抗生素使用情况有关。除此之外，北部地区分离的细菌对氨苄西林的耐药率也较高，中部地区分离的细菌对四环素和多黏菌素B的耐药率较高，南部地区分离的细菌对环丙沙星的耐药率较高。王国艳等[25]于2018年从山西太原地区分离的驴源性大肠杆菌对青霉素和多黏菌素B具有较高的耐药性，与山西中部地区细菌耐药性相似，这可能与不同地区气候条件、不同养殖场使用兽药的偏好不同有关。

由于细菌感染肺部会引起严重的猪呼吸系统疾病，从而影响猪群生产性能，所以，在养猪过程中，应该加强饲养管理并提高猪群抗病能力[26-27]，通过饲喂抗生素替代物[28-29]控制细菌感染。在细菌性疾病的防治过程中，应通过药敏试验针对性选择敏感药物治疗，防止细菌耐药性的产生。同时，各地区应该建立抗生素使用记录系统和抗生素耐药性检测系统[30-31]，以调整该地区的抗生素药物的使用规范，为该地区防控猪呼吸系统疾病和合理用药提供参考依据，保障养猪业健康、可持续发展以及公共卫生安全。