基于外周血细胞的肾癌患者术后预后风险评估与精准化预测

牛路 薛博 高哈尔·卡德尔汉 刘华平 贾伟 吴波 陈勇全 仇丽霞 王东文

肾癌是中老年人泌尿系统常见的恶性肿瘤之一,其发病率在泌尿及男生殖系统中仅次于前列腺癌和膀胱癌[1]。研究显示,肾癌患者在长期随访中的生存率不容乐观,术后5年生存率仅74%[2],因此明确肾癌的预后影响因素十分重要。目前的研究结果证实,影响肾癌预后的因素主要包括肿瘤分期、Fuhrman分级、肿瘤大小、体能状态、病理性坏死等,国外有研究基于上述因素构建了UISS评分系统、SSIGN评分系统和Leibovich预测模型[3-5],但这些预测模型均基于欧美人群设计,其在国内人群中的应用价值有待探究。近年来基于Cox的预后模型已被应用于各类癌症并成为可靠的预后预测工具[6-8],其通过可视化的方式(如线段式列线图)可以针对患者的预后进行准确预测[9],且预测效果优于传统基于临床分期的预后判断[10]。本研究在此基础上纳入外周血细胞参数构建Cox回归模型,通过直观的可视化工具实现对肾癌患者术后风险评估和个性化生存分析预测,进一步为临床医师制定诊疗策略提供更多的数据支持。

对象与方法

一、研究对象

本研究通过电子病历系统检索山西医科大学第一医院2011年1月至2016年12月接受手术治疗的肾癌患者的临床及术后随访资料,患者随访截止日期为2020年12月。纳入标准:①临床病理资料完整(术前检查及检验结果完整);②术后病理确诊为肾癌;③术前未进行任何与肿瘤相关的手术、放化疗及其他治疗者;④依从性良好,术后配合密切跟踪随访者。排除标准:①既往有其他恶性肿瘤病史或治疗史;②患有自身免疫性疾病或急慢性感染者;③患有血液系统疾病或血栓性疾病或正在行抗凝治疗者;④患有影响患者生化指标的其他疾病如上呼吸道感染等;⑤随访期间因其他疾病导致死亡的患者。本研究遵循的程序符合2013年修订的世界医学协会赫尔辛基宣言[11]要求。

二、资料收集

包括患者的一般人口学信息(性别、年龄、吸烟史、饮酒史、体质量指数)、临床因素(血尿史、高血压病史、糖尿病病史、肾癌家族史,术前肿瘤侧别、手术类型、肿瘤病理类型、肿瘤直径、Fuhrman分级)以及血常规(白细胞、中性粒细胞、血小板、淋巴细胞、单核细胞)、血生化检查(纤维蛋白原、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇)结果。术前血液指标检测在术前1周内收集,并计算出中性粒细胞与淋巴细胞比值(neutrophil-to-lymphocyteratio, NLR)、血小板与淋巴细胞比值(platelet-to-lymphocyte ratio, PLR)、淋巴细胞与单核细胞比值(lymphocyte-to-monocyteratio, LMR)。

本研究中所有患者的随访资料均以门诊检查、住院复查、电话随访方式获得。患者在术后第1年每3个月随访1次,第2年每6个月随访1次,之后每年随访1次,直到死亡或退出研究。最后1次随访时间是2020年12月。

三、变量定义

肿瘤Fuhrman分级按照2016年WHO第4版肾脏肿瘤分类标准进行划分[12],并将Ⅰ级定义为低分级组,Ⅱ～Ⅲ级定义为中分级组,Ⅳ级定义为高分级组。总生存(overall survival, OS)期定义为术后至任何原因导致的死亡或随访结束的时间。

四、统计学方法

定量资料采用均数±标准差或中位数、四分位数表示,定性资料采用构成比表示,离散型资料采用单因素Log-rank检验,连续型变量采用PH假定检验,满足PH假定检验(P>0.05)的变量运用单因素Cox回归分析;构建多因素Cox回归模型,在此基础上输出可视化结果(森林图),利用线段式列线图可视化分析个体预测概率;最后采用时依受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线评价Cox回归模型的稳定性。检验水准α=0.05。应用SPSS 22.0软件进行统计分析,统计推断采用R语言(4.0.2版本),运用survival包进行单因素、多因素Cox回归分析,运用ggforest包绘制森林图,运用regplot包绘制线段式列线图,运用riskRegression包绘制时依ROC曲线。

结 果

一、患者的基本资料

本研究共纳入251例患者,其中男152例(60.6%),女99例(39.4%),男女患者比例为1.54∶1;平均年龄(65.25±9.92)岁;平均随访时间(84.05±14.37)个月,中位随访时间85.21(74.59,95.24)个月;死亡66例(26.3%),失访46例(18.3%),见表1。

表1 肾癌患者基本资料

二、肾癌预后因素的单因素分析

对单因素分类变量的Log-rank检验结果显示,患者性别、血尿史、Fuhrman分级在生存和死亡组间的差异有统计学意义(P<0.05),见表2。不同性别、血尿史和Fuhrman分级患者的生存曲线见图1,女性患者的OS率高于男性患者(P=0.017);无血尿史患者的OS率高于有血尿史患者(P=0.002);Fuhrman低分级患者的OS率高于Fuhrman高分级患者(P<0.001),差异均有统计学意义。

表2 单因素分类变量的Log-rank检验

A:不同性别患者的生存曲线;B:有、无血尿史患者的生存曲线;C:不同Fuhrman分级患者的生存曲线图1 不同性别、血尿史和Fuhrman分级患者的生存曲线图

对连续型变量的PH假定检验显示,偏残差与时间秩次之间的Pearson相关系数中白细胞(r=0.156,P=0.259)、中性粒细胞(r=0.227,P=0.098)、淋巴细胞(r=-0.162,P=0.243)、单核细胞(r=0.050,P=0.718)、NLR(r=0.201,P=0.144)、PLR(r=0.082,P=0.554)、LMR(r=-0.133,P=0.337)、纤维蛋白原(r=-0.178,P=0.197)、总胆固醇(r=0.025,P=0.857)差异均无统计学意义,满足风险比例Cox回归模型的PH假定要求,可直接进行Cox回归分析。

连续型变量的单因素Cox回归分析结果如表3所示,其中白细胞(HR=1.88,95%CI:1.51～2.33)、中性粒细胞(HR=1.94,95%CI:1.64～2.30)、单核细胞(HR=1.55,95%CI:1.27～1.89)、NLR(HR=1.52,95%CI:1.36～1.71)、PLR(HR=1.79,95%CI:1.49～2.15)、纤维蛋白原(HR=1.34,95%CI:1.17～1.55)是肾癌预后的危险因素,而淋巴细胞(HR=0.47,95%CI:0.35～0.63)和LMR(HR=0.11,95%CI:0.05～0.23)是其保护因素,与肾癌患者的预后关系存在统计学意义(P<0.05),其余变量与肾癌患者预后无统计学意义(P>0.05)。

表3 连续型变量的单因素Cox回归分析

三、肾癌预后因素的多因素分析及森林图绘制

将单因素分析中与OS相关的因素进行多因素分析,结果如图2所示,计算其每增加一个标准差的HR和95%CI,其中Fuhrman分级(HR=1.76;95%CI:1.11～2.80)、中性粒细胞(HR=3.18,95%CI:1.57～6.44)、单核细胞(HR=1.58,95%CI:1.01～2.49)、PLR(HR=1.42,95%CI:1.03～1.97)是肾癌预后的危险因素;对相关因素进行多重共线性检验可知,白细胞和中性粒细胞的方差膨胀因子相对较大,受其影响,NLR(HR=0.57,95%CI:0.35～0.94)是肾癌预后的保护因素,差异均有统计学意义(P<0.05)。肾癌预后风险森林图可视化结果显示了各变量对预后的影响情况,对图2中的多因素分析结果进行举例说明:Fuhrman分级每增加1级,肾癌患者死亡风险增加0.76倍。

注:*P<0.05;**P<0.01图2 肾癌患者OS影响因素的森林图

四、线段式列线图的绘制

本研究基于多因素Cox回归模型结果绘制线段式列线图,预测肾癌患者术后3年、5年、8年的生存率。如图3所示,在PLR、NLR、单核细胞、中性粒细胞、Fuhrman分级影响下,该个体(直到最后一次随访结束出现死亡)总得分为169分,对应的术后3年、5年、8年死亡率分别为0.39%、1.18%和13.10%,生存率分别为99.61%、98.82%和86.90%。

注:*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001图3 个性化列线图预测肾癌患者术后3年、5年、8年生存率

五、模型稳定性的时依ROC曲线验证

利用单个肾癌患者的生存时间,可以在多个时间点构建ROC曲线,并输出各个时间点对应的ROC曲线下面积(area under the curve, AUC),以验证模型的稳定性。如图4所示,患者术后3年、5年、8年生存率的AUC分别为0.692、0.679和0.714,模型随时间变化幅度较小,稳定性较好,表明在一定的时间范围内上述生存分析是有效的。

图4 Cox回归模型的时依ROC曲线

讨 论

本研究回顾性分析了251例肾癌术后患者的一般人口学信息、临床因素及血常规、血生化资料,运用单因素联合多因素回归分析寻找潜在影响肾癌患者术后结局的影响因素,并利用线段式列线图输出预后因素对12号个体术后3年、5年、8年的生存率进行预测,最后采用时依ROC曲线评价Cox回归模型的稳定性,以此探讨影响肾癌患者预后的相关因素,从而为肾癌患者个性化干预治疗提供统计学数据支持。

本研究发现,Fuhrman分级是肾癌预后的独立危险因素,经森林图进一步将结果可视化,观测到Fuhrman分级每增加1级,其对肾癌的危险性可增加0.76倍,这与Murase等[13]的研究一致。Fuhrman分级是评价肾癌侵袭性最常用的预后参数之一,除了提供与结果预测有关的信息外,还可为肾癌的综合治疗提供一定信息[14]。

越来越多的研究证据表明癌症相关炎症反应在其发生和发展过程中起着至关重要的作用。其中炎症微环境的变化主要体现在中性粒细胞增多,同时伴有相对淋巴细胞减少和单核细胞增多[15-16]。本研究绘制的森林图显示,中性粒细胞和单核细胞均是影响肾癌预后的危险因素,每增加1个单位,其危险性分别增加1.04、8.27倍。癌症患者体内中性粒细胞增多通常是由于癌症相关炎症因子引发的[17],升高的循环中性粒细胞含有血管内皮生长因子[18],并通过抑制免疫细胞的溶细胞效应来抑制免疫系统功能[19],加速肿瘤的进展。巨噬细胞是源于外周血中循环的单核细胞的组织驻留细胞,在先天免疫调控中发挥主要作用。当肿瘤进展为恶性肿瘤时,肿瘤相关巨噬细胞会刺激血管生成,增强肿瘤迁移和侵袭,并抑制抗肿瘤免疫[20]。综合来看,中性粒细胞和单核细胞均可作为肾癌预后的独立危险因素。

与此同时,多种基于循环血细胞的预后生物标志物在各种肿瘤的预后预测中被广泛应用,如NLR、PLR等分别在结直肠癌[21]、食管癌[22]中被鉴定为预后标志物。在本研究中,NLR、PLR均是肾癌预后的独立影响因素,其中NLR为肾癌的保护因素,PLR则是危险因素。

对于NLR在肾癌中的作用及影响目前尚无定论,NLR作为一种炎性标志物,能反映免疫系统的活性,高NLR可能是全身和局部炎症的标志物,可以为肿瘤的发展和转移提供有利的微环境[23]。Sejima等[24]通过Fas介导的凋亡通路证明了NLR与免疫系统活性水平之间有一定的关系,认为NLR在其中作为疾病危险因素。PLR可以很好地反映癌症的预后,淋巴细胞减少是免疫反应弱的典型特征,高水平的单核细胞计数说明肿瘤负荷较大。淋巴细胞起着介导免疫监视和免疫编辑的功能,淋巴细胞的浸润是肿瘤微环境中阻止保护性免疫反应的必要条件[25],而低淋巴细胞计数直接体现出患者对肿瘤的弱免疫反应状态[26]。有研究发现,PLR升高与肾癌患者生存期和无病生存期较差有关[27],是肾癌OS和无进展生存期的独立预测因子[28]。

在本研究中我们探讨了肾癌患者术后的预后影响因素,与UISS评分系统、SSIGN评分系统和Leibovich预测模型相比,本研究着重关注了血清学指标及其延伸数值,根据患者的具体特征绘制列线图以精准预测患者术后3年、5年、8年的生存率,在对个体化病情评估时,本列线图可以为患者提供预后信息,为预后治疗方案的决策提供有价值的参考。但本研究也存在一些局限性,本研究为单中心研究,纳入的样本量相对较少,且并未对患者术后的炎症指标进行规律监测,故无法进一步探讨患者手术前后炎症指标的变化及其与肿瘤预后的关系。因此各变量对肾癌预后的影响还需要做进一步的探究。