基于荧光法及分子对接研究黄褐毛忍冬抑制丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶活性

杨 欣,肖俊伟,唐婷婷,危 英,陈 英,向良珊,周 英

丙型肝炎是因为感染丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)引起的慢性疾病,易发展为慢性丙型肝炎、肝硬化和肝癌,其传播主要与输血有关。HCV由于病毒株高度变异性导致疫苗的开发变得非常困难,目前尚无针对 HCV的疫苗[1-2]。人类使用植物药治疗疾病已有上千年的历史,一些天然产物显示出抗病毒的活性,如抗疱疹病毒、流感病毒、获得性免疫缺陷综合征、乙型肝炎病毒和HCV等[3-4]。黄褐毛忍冬(LonicerafulvotomentosaHsuetS.C.Cheng)为忍冬科、忍冬属藤本植物,具有清热解毒,疏散风热的功效,主治温病发热、热毒血痢、痈肿疔疮等多种感染性疾病[5],分布广泛,资源丰富,且产量高。2020版《中国药典》将其收载为山银花基源植物之一[6],该药材在民间常用于代茶饮,其水煎剂或醇提物已制成药,如双黄连注射液、银黄注射液等已作为抗病毒药物广泛应用于临床。该研究采用荧光法和分子对接技术检测黔产道地药材黄褐毛忍冬抗HCV NS3/4A 蛋白酶活性,拟期从中药、民族药中发现更多的抗病毒药效物质,阻断HCV的复制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验药材来源 黄褐毛忍冬药材于2016年3月采自贵州兴义,由贵州中医药大学陈德媛教授鉴定为LonicerafulvotomentosaHsuetS.C.Cheng,植物标本存放在贵州中医药大学科研楼中药民族药活性筛选实验室(标本号为LF201607)。

1.1.2实验试剂 HCV NS3/4A蛋白酶 、HCV 蛋白酶试剂盒购自美国AnaSpec公司;信筒子醌购自美国Sigma Aldrich 公司;绿原酸、异绿原酸A、木犀草苷、木犀草素、灰毡毛忍冬苷乙购自成都德锐可生物有限公司,样品纯度≥98% 。

1.1.3实验仪器 Synergy Ⅱ酶标仪购自美国Bio Tech 公司 ,分析天平MS205DU购自瑞士Mettler Toledo公司,384孔板购自美国Corning公司,Mili-Q系统超纯水购自美国Millipore 公司,DMSO购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1黄褐毛忍冬不同提取物及主要活性成分 取黄褐毛忍冬药材25 g,共4份,粉碎,分别加250 ml的蒸馏水、30%甲醇、60%甲醇、85%甲醇,超声2 min后,加热回流提取3次,第1、2次回流提取1 h,第3次回流提取30 min,合并提取液,减压浓缩成浸膏,真空干燥,采用 UPLC-HRMS 技术对黄褐毛忍冬水提物及不同醇提物的化学成分变化情况进行研究[7]。结合对照品比对、液质提供的精确分子量和多级质谱碎片离子信息进行定性分析,根据 Lipinski 类药五原则进行筛选。

1.2.3受体与配体文件准备 从蛋白质晶体结构数据库RCSB (http://www.rcsb.org/pdb ) 获取HCV蛋白酶(PDB ID:1NS3)。利用 SYBYL2.1.1 对蛋白晶体结构进行抽离配体、删除水分子、加氢、修复侧链氨基酸、加电荷、提取配体等前处理,保存备用;运用 SYBYL2.1.1 构建黄褐毛忍冬主要活性成分配体库并完成分子优化,设置参数:选择 GasteigerHückel 电荷,采用 Tripos 力场,最大迭代系数设置为 10 000,其它参数均设为默认值。

1.2.4SYBYL 2.1.1分子对接实验 基于 SYBYL2.1.1 的 Docking Suite 模块,读取已生成的受体 SFXC 格式文件开始对接工作[9]。实验结果以总分>5为阈值,采用Ligplot1.4.5软件进行相互作用分析。实验结果以氢键、疏水作用和结构比对输出,筛选关键的氨基酸位点。

1.2.5实验验证分析 采用荧光法验证6个黄褐毛忍冬中主要成分(绿原酸、异绿原酸A、木犀草苷、木犀草素、灰毡毛忍冬苷乙和常春藤皂苷元)抑制HCV NS3/4A蛋白酶的活性[10-13]。使用SensoLyteTM 520荧光HCV NS3/4A 蛋白酶试剂盒,操作方法与前面实验保持一致性。

2 结果

2.1 黄褐毛忍冬不同溶剂提取物体外抑制HCV NS3/4A 蛋白酶活性在浓度为1.0、0.1和0.01 mg/ml时,黄褐毛忍冬不同溶剂提取物对HCV NS3/4A蛋白酶具有不同程度的抑制作用(表1),IC50值范围为0.005～0.019 mg/ml,其中黄褐毛忍冬60%醇提物显示较强的抗HCV NS3/4A蛋白酶的活性。

表1 黄褐毛忍冬不同溶剂提取物体外抑制HCV NS3/4A 蛋白酶活性

2.2 配体优化绿原酸、异绿原酸A、木犀草苷、木犀草素、灰毡毛忍冬苷乙、常春藤皂苷元6个活性成分可遵循Lipinski 类药五原则。基于SBYBL对黄褐毛忍冬活性成分进行优化,图1A为未优化的活性成分棒状模型(Sticks),共有6个配体,红色代表氢原子,蓝色代表氧原子。对小分子配体进行基于Tripos力场的能量最小化计算,优化分子结构,获得合理构象(图1B)。

图1 黄褐毛忍冬主要活性成分优化

2.3 受体优化基于PDB数据库下载HCV蛋白酶结构见图2A,Resolution:2.80 Å,通过SYBYL去水、加全氢、加电子,选择Ligand(B/ZN690)模式形成口袋。图2B绿色区域为对接口袋的位置,是受体中配体结合的区域。

图2 HCVNS3/4A蛋白酶优化及结合口袋

2.4 分子对接分析基于原配体进行对接,阳性对照信筒子醌与HCV蛋白酶的 总分为 7.1,C分数值为 5,说明信筒子醌与HCV 蛋白酶结合能力较好。绿原酸、异绿原酸A、木犀草苷、木犀草素与HCV蛋白酶有较好的结合(总分>5),其中异绿原酸A、木犀草素与HCV蛋白酶结合能力接近阳性对照药(表2),课题组将采用实验研究验证分子对接的结果。

表2 黄褐毛忍冬主要活性成分与HCV蛋白酶分子对接

2.5 相互作用分析运用 Ligplot1.4.5软件对结合较好的蛋白复合物相互作用力进行分析,明确氢键和疏水作用力在对接中起着重要的作用。绿原酸与HCV结合后形成4个氢键(Ser139、 His57、 Lys136、Arg109);异绿原酸A与HCV结合后形成7个氢键(Gly137、Lys136、Cys159、His57、Ser42、Arg156、Thr40);木犀草苷与HCV结合后形成2个氢键(Lys136、Gln41);木犀草素与HCV结合后形成1个氢键(Gln41);信筒子醌 与HCV结合后形成3个氢键(Ser42、Lys136、Thr40)。

2.6 荧光法测试黄褐毛忍冬主要化合物抗HCV NS3/4A 蛋白酶活性在浓度为0.01 mg/ml时, 结果显示均具有抑制HCV蛋白酶活性(表3),其中异绿原酸A和木犀草素对HCV NS3/4A蛋白酶抑制率分别为60.5%和43.1%。异绿原酸A、木犀草素的IC50值分别为0.008 mg/ml和0.019 mg/ml。

表3 黄褐毛忍冬主要活性成分抑制HCV NS3/4A 蛋白酶活性(n=3)

3 讨论

HCV是引发肝脏疾病的主要病因,对人类健康影响较大,尚无疫苗预防 HCV 感染,近 10 年来治疗主要以利巴韦林联合长效聚乙二醇 I 型干扰素,但是存在联合抗病毒治疗无效的情况,同时也容易出现副作用,如抑郁症、机体免疫下降、贫血等,且联合用药周期长,因此在临床上应用受限。HCV复制的两个主要药物病毒因子包括RNA聚合酶NS5B和非结构蛋白NS3/4A[14]。目前已经成为人们筛选药物的关键靶点,且取得了较大的进展,但临床治疗药物治疗费用较高,不能让所有患者受益。因此不断从中药中开发低毒、高效、安全的抗病毒小分子用于HCV的治疗具有现实意义。黄褐毛忍冬60%醇提物具有较强的抗HCV 蛋白酶活性,其有效部位单独或与其他药物复配,可用于研制治疗丙型肝炎药物的原料药[15]。分子对接和实验结果发现其主要成分木犀草素和异绿原酸A显示较好的抗HCV的作用,为从中药和民族药中开发丙型肝炎非肽类药物提供依据。