Wnt2/β-catenin通路在C57BL/6小鼠肝再生修复中的变化

姚路远,刘 云,杨 茜,鲍 欣,王 琰,赵小英,唐俊明

肝再生是一个复杂的过程,涉及肝脏中的多种细胞类型,包括肝细胞、肝星状细胞、肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cells, LSEC)和Kupffer细胞等[1]。肝细胞是主要的实质细胞,占肝功能的很大一部分[2]。健康的肝脏中细胞有丝分裂是静止的,但在受损伤或切除后,细胞可以迅速进入细胞周期,恢复肝脏的质量和功能。在肝再生过程中,肝实质细胞和LSEC密切配合促进肝脏质量和功能的修复[1]。Wnt基因最初来源于小鼠乳腺癌中的整合酶-1和果蝇的无翅基因,Wnt通路也被称为Wnt2/ β-catenin通路,涉及β-catenin的核转位。β-catenin进入细胞核与TCF/LEF转录因子激活靶基因,该通路主要控制细胞增殖[3]。既往研究[4]表明Wnt2/β-catenin通路在肝脏发育、稳态和代谢中起着关键作用,但其在肝脏再生修复中的作用尚不清楚。该研究旨在探讨小鼠部分肝切除术(partial hepatectomy, PHx)后,肝再生修复过程中Wnt2/β-catenin的表达特征及作用,为临床中PHx后的患者改善肝脏功能,降低术后病死率提供理论基础和新的靶标。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 11周龄C57BL/6小鼠,雄性,体质量24～30 g,购自湖北医药学院实验动物中心,饲养于SPF环境中,动物许可证号SYXK(鄂)2019-0031,湖北医药学院实验动物伦理委员会批准[批准号:湖北医药学院动(福)第2021-实029号]。

1.1.2主要试剂 异氟烷购自美国RWD公司;TRIzol购自美国Ambion公司;丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)生化分析试剂盒 、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST) 生化分析试剂盒购自南京建成生物技术研究所;组织自发荧光淬灭剂A液、B液购自武汉赛维尔生物科技有限公司;防淬灭封片剂购自美国Southern Biotech公司 ;苏木精购自武汉赛维尔生物科技有限公司;Anti-LYVE1 Rabbit pAb、Anti-HNF-4-α Rabbit mAb购自英国Abcam公司;Anti-Ki67 Mouse mAb购自武汉赛维尔生物科技有限公司;Anti-GAPDH Mouse pAb购自美国Bioworld公司。HRP Goat Anti Rabbit IgG H+L、HRP Goat Anti Mouse IgG H+L购自武汉安特捷生物技术有限公司;荧光二抗AlexaFluor®594 Donkey Anti-Mouse IgG H+L、AlexaFluor®488 Donkey Anti-Rabbit IgG H+L购自美国Jackson Immuno Research公司;PMSF购自大连美仑生物技术有限公司;BCA蛋白定量试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;ECL试剂盒购自美国Millipore公司;RIPA 购自大连美仑生物技术有限公司;DAPI购自美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1小鼠肝切除再生模型构建 11周龄C57BL/6雄鼠随机分为6组,Sham组、术后1 d组、术后2 d组、术后4 d组、术后6 d组、术后8 d组,手术均在SPF环境中操作。术前称体质量,用异氟烷麻醉后,将小鼠置于保温垫上,胶带固定四肢。用碘伏消毒腹部3遍,横切口打开腹腔,分别用棉签暴露出肝左叶和中叶,用棉线结扎肝左叶和中叶根部并切除。检查残端无出血后,用4#手术缝合线迅速缝合伤口,Sham组仅腹腔切开后缝合处理。

1.2.2肝功能检测 行PHx后,于术后1、2、4、6、8 d取材,小鼠经吸入异氟烷麻醉后,心尖取血,经4 ℃,3 500 r/min 离心10 min后,收取血浆,利用南京建成公司AST、ALT试剂盒检测血浆中肝功能指标AST、ALT水平变化,分析术后小鼠肝功能情况。

1.2.3免疫组化染色 组织依次固定、脱水、透明、浸蜡、包埋,组织切片5 μm。将切片脱蜡、复水后置于pH6.0 枸橼酸钠中,放入微波炉抗原修复。PAP阻水笔画圈后每个组织加30 μl 3%过氧化氢去除内源性过氧化物酶,PBS洗涤3次,每次5 min。含0.3%Triton X-100的5%山羊血清封闭液室温封闭1 h,去除封闭液后,于每组切片分别滴加30 μl 一抗Anti-Ki67(1 ∶600),湿盒内4 ℃孵育过夜。放入室温复温30 min后用含0.1%吐温-20的PBS溶液洗涤3次,每次5 min。用山羊抗小鼠二抗(1 ∶600)室温孵育1 h,PBST洗涤3次,每次5 min。DAB染色后超纯水冲洗5 min,苏木精复染核1.5 min,超纯水冲洗10 min。1%盐酸乙醇分化5 s后超纯水洗,PBS返蓝后梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。

1.2.4免疫荧光染色 将上述组织抗原修复后,用组织自发荧光淬灭剂A液30 μl室温孵育30 min,超纯水冲洗5 min。用5%驴血清室温封闭1 h,一抗Anti-Ki67(1 ∶600)、Anti-HNF-4-α,(1 ∶2 000)、Anti-LYVE1(1 ∶1 000)、Anti-β-catenin(1 ∶100),4 ℃孵育过夜。放入室温复温30 min后用PBST溶液洗涤3次,每次5 min。加入荧光二抗(1 ∶500)室温孵育1 h,PBST洗3次,每次5 min,DAPI(1 ∶2 000)复染细胞核5 min。PBST洗3次,每次5 min,滴加组织自发荧光淬灭剂B液30 μl室温避光孵育5 min,超纯水冲洗5 min,PBS中洗涤3次,每次5 min,切片稍甩干后滴加防淬灭封片剂封片。

1.2.5Western blot检测Wnt2的表达变化特征 取各时间点肝脏组织 50 mg 于EP管中,加入RIPA和PMSF混合物 500 μl(RIPA ∶PMSF=100 ∶1),多通道组织匀浆机匀浆。冰上静置30 min后,4 ℃、12 000 r/min离心15 min,离心后取上清液即为肝组织总蛋白。采用 BCA 蛋白浓度检测试剂盒对各组肝组织蛋白样品进行BCA定量分析后,加入1/4体积的5×上样缓冲液煮沸 5 min 使蛋白变性。行SDS-PAGE凝胶电泳进行蛋白分离;220 mA、60 min 的条件下转至 PVDF 膜,5%脱脂牛奶室温封闭 PVDF 膜1 h;一抗Anti-Wnt2 (1 ∶1 000)、Anti-GAPDH (1 ∶10 000) 4 ℃孵育过夜,TBST 漂洗 3 次;二抗(1 ∶10 000)室温孵育1 h,TBST 漂洗3次。使用 ECL 试剂盒显影成像,使用Image J软件测量Wnt2和GAPDH灰度值,并用Wnt2/GAPDH进行半定量分析。

2 结果

2.1 PHx后肝质量变化的时间动力学特征为了观察PHx后不同时间点小鼠肝质量变化的特征,分别于PHx后1、2、4、6、8 d称取小鼠体质量和肝质量。与Sham组比较,术后第1天肝体积最小,第2天体积开始变大,到术后第6天达到高峰(图1)。肝切后第1天肝质量、肝质量/体质量最低(P<0.000 1),第6天就恢复到接近Sham组水平(表1)。经统计学分析,各组肝质量和肝质量/体质量结果差异有统计学意义(肝质量:F=26.317,P<0.000 1;肝质量/体质量:F=47.527,P<0.000 1)。结果表明,小鼠PHx后肝脏具有强大的再生修复能力,能快速使肝质量恢复至相对正常水平。

表1 PHx后肝质量变化的时间动力学特征

图1 PHx后各组肝组织形态变化

2.2 PHx后肝功能变化的时间动力学特征为了观察PHx后肝脏质量变化过程中肝脏功能变化的特征,于PHx后1、2、4、6、8 d收集血浆,用ALT、AST试剂盒检测血浆中肝脏功能指标ALT和AST的水平。结果显示肝切后ALT、AST水平均于第1天显著升高(ALT:P<0.01;AST:P<0.001),第2天迅速恢复至接近正常水平,到第4天完全恢复到Sham组水平(图2)。经统计学分析,各手术组和Sham组之间的肝功能水平差异有统计学意义(ALT:F=33.916,P<0.000 1;AST:F=62.559,P<0.000 1)。这一结果提示PHx后肝脏再生修复过程中,肝脏的功能迅速从损伤状态恢复到正常水平。

图2 PHx后肝功能变化的时间动力学特征

2.3 PHx后肝脏细胞增殖能力变化特征为了探索PHx后肝脏再生修复与细胞增殖变化的关系,行Ki67免疫组化染色。与Sham组比较,PHx后肝脏Ki67阳性细胞数于第1天开始增多,于第2天达到高峰(P<0.000 1),从第4天开始逐渐下降,第8天恢复到接近正常水平。经统计学分析,各手术组和Sham组之间的Ki67阳性细胞数差异有统计学意义(F=214.981,P<0.000 1)。为了探明Ki67阳性细胞的种类,本研究分别用肝实质细胞的特异标志物HNF4-α和LSEC的特异标志物LYVE1与Ki67做免疫荧光共定位,结果显示 HNF4-α和Ki67双阳性细胞数于第1天开始增多,第2天达到高峰(P<0.000 1),然后逐渐下降,第6天恢复到接近正常水平。经统计学分析,手术组和Sham组之间的HNF4-α、Ki67双阳性细胞数差异有统计学意义(F=100.037,P<0.000 1)。LYVE1和Ki67双阳性细胞数在术后第1天降低,第4天升高达到峰值(P<0.000 1),第6天开始降低,于第8天恢复至Sham组水平。经统计学分析,各手术组和Sham组之间的LYVE1、Ki67双阳性细胞数差异有统计学意义(F=31.13,P<0.0001)。结果表明,PHx后第2天主要是肝细胞增殖,第4、6天主要是LSEC增殖。见图3。

图3 PHx后肝脏细胞增殖能力变化特征

2.4 PHx后小鼠肝组织Wnt2/β-catenin表达变化情况为研究Wnt2/β-catenin通路与肝再生的关系,先检测了PHx后肝脏中Wnt2蛋白的表达。Western blot结果显示,与Sham组比较,术后第1天和第4天Wnt2蛋白表达达到峰值(P<0.000 1,P<0.001),见图4。经统计学分析,手术组和Sham组之间的Wnt2蛋白表达差异有统计学意义(F=43.89,P<0.000 1)。表明Wnt2通路可能参与了肝再生修复过程;进一步检测了β-catenin被激活转入核内的情况,β-catenin免疫荧光定位结果显示,术后第1、2、6、8天β-catenin入细胞核数显著增多(P<0.001,P<0.01,P<0.001,P<0.05),见图5。经统计学分析,手术组和Sham组之间的β-catenin入核细胞数差异有统计学意义(F=66.465,P<0.000 1)。上述结果表明肝再生修复过程中Wnt2/β-catenin通路被激活。

图4 PHx后肝组织中Wnt2蛋白表达的变化特征

图5 PHx后肝组织中β-catenin激活的变化特征

3 讨论

肝脏是一种具有丰富的再生能力的独特器官。因此,PHx或部分肝移植可以安全进行[5]。PHx后门静脉血流或压力的剧烈变化、组织缺血/缺氧可能是肝再生的主要触发因素和驱动力[6]。肝脏是唯一一个利用再生机制来确保肝质量/体质量始终达到体内平衡所需质量的100%的实体器官[7]。本研究发现,PHx后小鼠肝质量、肝质量/体质量逐渐升高,第6天达到高峰,接近Sham组水平。PHx后受损、坏死的肝细胞释放ALT、AST入血,同时门静脉血流或压力的剧烈变化、肝组织缺血、缺氧触发肝再生修复。本研究结果显示,在术后第1天ALT、AST水平显著升高,第2天迅速恢复至接近正常水平。小鼠肝功能恢复的峰值和Ki67阳性细胞数峰值一致,提示PHx后肝脏中的细胞快速增殖促进了肝功能的恢复。因此,在肝损伤修复的早期,提高患者肝脏中细胞的增殖能力,是减少肝切除术后肝功能衰竭可能的策略。

肝再生是一个复杂的过程,涉及多种细胞类型的对话,包括肝细胞、肝星状细胞、内皮细胞和炎症细胞。健康的肝脏细胞有丝分裂是静止的,但在毒性损伤或切除后,细胞可以迅速进入细胞周期,恢复肝脏的质量和功能。在这个再生过程中,实质细胞和非实质细胞以一种紧密协调的方式进行反应[8-9]。本研究发现在PHx后第2天肝实质细胞增殖达到高峰,从第4天开始逐渐降低;而LSEC增殖在PHx后第1、2天降低,第4天达到增殖高峰,第6天开始降低。这一结果说明了PHx后2～4 d是肝再生修复的关键阶段,肝实质细胞和LSEC分别起着重要作用,共同促进肝脏再生修复。

Wnt2/β-catenin信号通路对胚胎发育和肿瘤的发生发展起着重要作用[10]。研究[11-12]表明该通路在肝脏的发育、成熟和分化中也扮演着重要角色。在无Wnt配体的情况下,破坏复合物(CK1α、GSK3β、Axin、APC蛋白形成的复合物)可磷酸化β-catenin,靶向其进行泛素依赖性蛋白酶体降解。当配体Wnt结合其同源受体Frizzled和共受体LRP5/6时,破坏复合物被招募到细胞膜上,从而减少破坏复合物对β-catenin的降解。β-catenin在细胞质中积累,并转入细胞核激活下游靶基因[13-14]。在成熟的健康肝脏中,Wnt2/β-catenin通路大多不活跃,但在细胞更新或再生过程中,以及在某些病理条件,如疾病、恶性肿瘤中会重新激活。本研究发现,PHx后第1天和第4天Wnt2表达增加;β-catenin在第1天入核增加,第2天肝实质细胞增殖就达到峰值;术后第2天β-catenin入核增加,第4天LSEC增殖达到峰值。该结果预示了Wnt2/β-catenin通路的激活,直接或者间接参与了肝脏再生修复。

β-catenin被激活入核主要出现在PHx后第1、2、6和8天,而Wnt2蛋白表达的峰值在第1天和第4天,即第4天Wnt2蛋白表达峰值的时间在第2天β-catenin入核之后,提示β-catenin受Wnt2激活入核,并正反馈促进Wnt2的表达,下一步课题组将对该现象的机制进行研究。

综上所述,小鼠PHx后,肝脏有强大的再生修复能力,能使肝脏功能快速恢复至正常水平。本研究证实了肝实质细胞和LSEC增殖的同时Wnt2/β-catenin通路被激活,说明该通路在小鼠肝脏再生修复中有重要作用,具体的作用与机制需要进一步研究。该课题为临床患者PHx后肝功能的恢复,防治肝功能衰竭提供了新的靶标和理论基础。