eIF2B1在肝细胞癌中的表达及意义

齐文月,周大臣,张振华,夏国美,陈 伟,邹桂舟

原发性肝癌是全球第六大癌症,居全世界癌症相关病死率的第三位[1]。在我国,肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的肝癌类型,占总病例的85%～90%[2]。肝癌由于其起病隐匿,早期易漏诊,大多数患者确诊时已处于疾病的中晚阶段,预后不佳,发现并研究新的分子靶点,是当前HCC的研究热点内容之一。近年来的研究[3]发现,蛋白质翻译的调控在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要的作用,但是在HCC中,目前还缺少足够的研究数据。蛋白质的翻译过程主要包括起始、延长和终止3个步骤,其中翻译的起始阶段被认为是蛋白质合成中重要的限速步骤,起始因子(translation initiation factor,eIFs)通过调控遗传密码来影响蛋白质的翻译,其中发挥重要作用的有eIF2、eIF2B、eIF4F复合物等。eIF2与eIF4F复合物是蛋白质翻译过程中两个关键调控点,前期研究[4]表明eIF4F复合物对HCC患者有一定的预后价值,但目前关于eIF2B1在HCC中表达的研究较少。基于此背景,该研究致力于探讨eIF2B1在HCC中的表达及其临床意义。

1 材料与方法

1.1 主要材料胎牛血清购自美国Gibro公司;一抗eIF2B1、eIF2α、P-eIF2α购自美国CST公司;山羊抗兔或抗鼠二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司;HCC细胞系HepG2和HepG2.2.15购自中国科学院上海细胞库,其中HepG2细胞指人肝癌细胞,HepG2.2.15是指稳定转染了HBV DNA的人肝癌细胞;BCA试剂盒和4%多聚甲醛购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1临床数据的收集与分析 从安徽医科大学第二附属医院现有的HCC组织标准库中,筛选出91例具有完整随访信息的,且与乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)相关的HCC术后患者的配对临床组织(包括肿瘤组织以及距肿物边缘>2 cm的癌旁组织),制作4套组织芯片(tissue microarray,TMA1～4)。所纳入HCC患者的标准:① 首次病理确诊为HCC;② 患者有乙型肝炎病史,首次诊断为HCC且年龄18～70岁;③ 术前未行放疗、化疗及相关抗肿瘤治疗。排除标准:① 混合型肝癌或合并其他肝脏恶性肿瘤;② 既往或同期伴有其它脏器恶性肿瘤,包括复发性HCC;③ 合并自身免疫系统疾病的患者;④ 临床病理资料不完整患者。随访通过与患者或患者家属的联系来保持对出院患者病情的追踪,具体内容包括:① 患者入院以来的肝功能指标;② 术后病理报告的肿瘤的大小、数目以及卫星灶;③ 出院之后的3年生存率和5年生存率以及生存状态等。该研究已通过安徽医科大学第二附属医院伦理委员会审查(编号:20200863)

1.2.2免疫组织化学 将组织芯片在60 ℃烘箱中烤片、脱蜡,然后将烤好的芯片依次放入二甲苯Ⅰ6 min,二甲苯Ⅱ6 min,二甲苯与无水乙醇3 min,无水乙醇6 min,90%乙醇3 min,70%乙醇3 min,50%乙醇3 min,纯水10 min梯度脱蜡;再将脱蜡完毕后的芯片放入装有枸橼酸钠缓冲液的染色槽内,在微波炉中进行抗原修复;将芯片浸入30%过氧化氢与甲醇1 ∶9体积混合的混合液中10 min,以封闭过氧化氢酶,用PBS冲洗15 min;破膜液破膜10 min,PBS冲洗15 min;用1%牛血清白蛋白封闭2 h;组织芯片与第一抗体在4 ℃环境下孵育过夜;室温下依次加入反应增强液20 min、辣根酶标记抗兔IgG聚合物30 min,以DAB为显色剂,苏木精5 s复染,最后用将切片放入50%乙醇3 min,70%乙醇3 min,90%乙醇3 min,无水乙醇6 min,二甲苯与无水乙醇3 min,二甲苯Ⅰ6 min,二甲苯Ⅱ6 min脱水,中性树脂封片。操作严格按照实验步骤完成,做好质控工作。染色判断标准为:eIF2B1主要在细胞质和细胞膜上显色,以浅黄到棕黄色定为阳性。以无染色、浅黄色、深黄色、黄褐色分别计为 0、1、2、3分。通过用Image J软件进行半定量分析计算阳性细胞比例,阳性率<5%计为0分,5%～25%计为1分,>25%～50%计为2分,>50%～75%计为3分,>75%计为4分,两项分值相加为最终评分,总分 0～7分,以≤3分为低表达,以>3分为高表达。

1.2.3Western blot检测 HepG2和HepG2.2.15细胞分别培养48 h后,吸去培养液,PBS洗3遍。加入已经配制好的蛋白裂解液100 μl冰上孵育25 min;用无菌细胞刮刮下细胞裂解液于无菌的1.5 ml离心管,4 ℃、13 200 r/min离心30 min,吸取上清液。采用BCA蛋白浓度检测法对其进行定量,随后用上样缓冲液和纯水配成等体积等浓度,10 min煮沸使其变性后离心,放置冰上冷却。使用SDS-PAGE分离总蛋白,并电转移到PVDF膜上。转膜后,在室温下用5% BSA TBST溶液中封闭2 h后,在4 ℃下与一抗孵育过夜。第2天,用山羊抗小鼠二抗或山羊抗兔二抗孵育1 h,洗膜后用显影仪检测目的蛋白。

1.3 统计学处理使用R 4.0.5及Graphpad Prism 8.0.2软件对实验数据进行统计分析。患者的临床特征与目标基因的表达水平通过非参数检验分析,组织芯片中各目标基因的表达水平的相关性通过程序包PerformanceAnalytics进行分析。绘制Kaplan-Meier生存曲线,并通过Cox回归分析计算各影响因素的HR值,通过Nomogram评估各影响因素与HCC患者预后的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 eIF2B1在HCC肝脏组织中的表达及临床特征相关性通过对纳入的HCC患者的肝脏肿瘤组织中的eIF2B1的表达进行半定量分析,统计eIF2B1在HCC患者中的表达情况。结果显示,肝脏肿瘤组织中eIF2B1的表达与HCC患者的肿瘤数目有显著统计学相关性 (P<0.05),而与性别、年龄、肿瘤最大径、分期等无显著统计学相关性 (P>0.05)。见表1。

表1 eIF2B1在不同临床特征分组中HCC肝脏组织表达分析

2.2 免疫组化及Western blot法检测eIF2B1的表达及与HCC患者的整体术后生存时间的相关性通过Kaplan-Meier生存曲线进行生存分析可得出结论,eIF2B1在HBV相关的肝癌中的表达与HCC患者总体生存率无明显统计学意义(图1A,P>0.05),但在HBV-DNA阳性患者中,eIF2B1的表达与HCC患者总体临床预后呈现显著相关性(图1B,P<0.05),eIF2B1高表达组总体生存率要低于eIF2B1低表达组;通过IHC染色检测及Western blot法检测HBV-DNA阳性的HCC肿瘤组织和癌旁肝组织中 eIF2B1的表达进一步证实了该结果(图1C、D)。

图1 eIF2B1的表达与HCC患者的整体术后生存时间的相关性

本研究纳入的患者入院时间主要是2000—2014年,由于当时条件及技术原因,部分指标的数据纳入不全

2.3 eIF2B1与eIF2α、P-eIF2α及临床特征之间的相关性分析相关性分析提示eIF2B1在HBV相关的HCC细胞中的表达与P-eIF2α的表达及肿瘤的数目、大小之间呈负相关(图2A、B)。通过Western blot法检测HepG2.2.15细胞中eIF2B1以及相关蛋白的表达,结果发现,与HepG2细胞系比较,HepG2.2.15细胞系中的eIF2B1表达水平显著增高,且eIF2B1的调控基因,如eIF2α以及其磷酸化水平也在两种不同的细胞系中体现出表达差异(图2C),进一步说明并验证了eIF2B1在HCC中的表达与HBV感染有关。

图2 eIF2B1与eIF2α、P-eIF2α及临床特征之间的相关性分析

2.4 eIF2B1在HBV-DNA阳性的HCC肝脏组织中表达的多因素Cox回归分析及Nomogram模型以Cox比例风险模型为基础,对HBV-DNA阳性患者的临床数据进行多因素Cox回归分析,并利用Nomogram算法进行评分,对各个危险因素的风险比例分别给予评分,以各患者最终得分综合来预测3年生存率和5年生存率,例如,得分为150分的患者3年生存率、5年生存率分别约为0.92、0.75。可以看到eIF2B1的评分相对较高,提示eIF2B1对于HCC患者预后生存时间有着显著的相关性。见图3。

图3 多因素Cox回归分析及列阵图模型

3 讨论

本研究发现,eIF2B1在HBV-DNA阳性的HCC患者肿瘤组织中的表达与HCC患者的临床预后具有显著相关性,提示eIF2B1在HCC的发生发展过程中具有一定的生物学作用。 国内的HCC病例主要是由HBV感染所致,HBV感染通过以下3种机制促进肿瘤的发展:① HBV DNA整合到宿主基因中诱导插入突变;② 由于HBV DNA与宿主基因组的整合和病毒蛋白质的活性,导致宿主基因组的不稳定性;③ HBV蛋白(HBx、HBc和preS)影响患者细胞功能、激活致癌通路,与其他危险因素相关的肿瘤比较,HBV相关的肿瘤具有更高的染色体改变率[5]。在本研究中,Western blot实验结果提示eIF2B1、eIF2α以及其磷酸化水平在HepG2.2.15及 HepG2细胞系中的表达具有明显差异性,这也表明HBV感染会影响基因在肝癌细胞中的表达。

HCC作为一种高增殖性肿瘤[6],在肿瘤细胞发生发展过程中涉及到多种基因的突变,蛋白质的翻译在病变过程中起到重要的作用。翻译的起始阶段是其中重要的限速环节,涉及到多种起始因子(eIFs),其中eIF2是一种α、β和γ亚基组成的GTP酶(GTPase),可被eIF2B激活[7]。eIF2B是一个异源十聚体复合体,由α到ε 5个亚基组成,分别由5个不同的基因eIF2B1～eIF2B5编码,位于不同的染色体上[8]。当发生病毒感染或在其他不同胁迫条件下,通过激活GCN2、PERK、PKR和HRI这四种激酶,使eIF2α亚基的Ser51发生磷酸化,磷酸化的eIF2更强地结合并抑制eIF2B,阻止非磷酸化的eIF2的循环[9],从而导致蛋白质合成的抑制。eIF2α的磷酸化激活可影响肿瘤细胞的生长和抗肿瘤治疗的疗效,在很多恶性肿瘤中eIF2α的表达增强,且肿瘤细胞的增殖与eIF2α的持续高表达有明显的相关性[7,10]。在本研究中,eIF2α在HCC肿瘤组织中呈高表达状态,且与eIF2B1的表达呈正相关,这也侧面验证了该结论。eIF2B是eIF2特有的鸟嘌呤核苷酸交换因子,通过将释放的eIF2-GDP循环到活跃的eIF2-GTP,并招募Met-tRNA形成新的eIF2-GTP·Met-tRNA三元复合物,这也是翻译起始阶段持续成功的关键,eIF2B比eIF2α少3～5倍,凸显了调节eIF2B活性的重要性[11]。目前对于eIF2B的研究主要在白质消融性白质脑病,也被称为“中枢神经系统髓鞘减少的儿童共济失调”,在eIF2B1～5基因中,任何一个基因突变均可导致白质消融性白质脑病。在编码eIF2B的5个基因中,目前对eIF2B5研究较多,Hou et al[12]通过分析癌症基因组图谱中eIF2B5在卵巢癌患者中的表达来评估预后意义,结果显示eIF2B5低表达是卵巢癌患者预后不良的独立危险因素。此外,研究表明eIF2B5在肺癌和乳腺癌中高表达[13-14],同时也是大肠癌病情进展的生物标志物[15]。eIF2Bα表达水平不足会降低eIF2B的活性,但关于eIF2B1在HCC中的研究,目前还缺少足够的研究数据。在本研究中,通过对eIF2B1与eIF2α、P-eIF2α之间相关性的分析,表明eIF2B1与P-eIF2α之间呈负相关,eIF2B1在HCC肝脏组织中的表达强于癌旁组织,且通过生存分析也提示在HBV-DNA阳性患者中,低表达组相较于高表达组有更好的生存率,提示eIF2B1在HBV相关的HCC发生发展过程中起到了一定的生物学作用。同时,本研究尚存在一些局限性,样本量的不足给本研究带来一定的影响,同时也导致诸多推测无法进一步实验验证。后续课题组将收集更多的标本数据,通过进一步的体内与体外实验,更全面、更深入地研究eIF2B1在HBV相关的HCC中的作用。