QDPR通过调控Beclin1改善UUO诱导的大鼠肾间质纤维化

2023-06-07 08:01高海洋何海兰张立国李治国
安徽医科大学学报 2023年5期
关键词:免疫组化输尿管纤维化

高海洋,何海兰,张立国,陈 曦,李治国

肾间质纤维化是许多进行性慢性肾脏疾病的共同途径,最终导致终末期肾衰竭,其发病机制十分复杂,主要特征是细胞外基质沉积、成纤维细胞积累、炎性细胞浸润等[1-3],目前缺乏有效治疗方法。因此,探讨肾间质纤维化的发病机制,对于预防和减轻肾间质纤维化具有重要意义。醌型二氢生物喋呤还原酶(quinoid dihydropteridine reductase,QDPR)在体外研究中发现有抗纤维化作用,过表达QDPR能减少转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的表达[4],提示其在肾间质纤维化中有重要作用。据报道,QDPR这一作用可能与自噬相关[5]。自噬是一种高度保守的细胞行为[6],其在单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)大鼠模型肾纤维化过程中起到双重作用[7-9]。自噬诱导肾小管萎缩和分解,从而促进纤维化[9],又可能通过抑制上皮间质转化进而抑制纤维化[8]。此外,研究[10]发现Beclin1是自噬过程的关键调节因子之一。因此,该研究拟通过构建过表达QDPR的UUO模型,探讨QDPR是否通过调控Beclin1的表达进而调控肾间质纤维化,为肾间质纤维化发病机制的研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂慢病毒由华北理工大学李治国教授课题组自制;QDPR抗体、α-SMA抗体(美国Proteintech公司);COL Ⅰ(武汉博士德生物工程有限公司);E-Cadherin (ECa)抗体、Beclin1抗体(美国Proteintech公司);山羊抗兔抗体(英国Abcam公司);枸橼酸三钠、柠檬酸(天津大茂化学试剂厂);DAB(德国Sigma公司);Masson染色试剂盒(珠海贝索生物科技有限公司)。

1.2 实验动物3周龄,雄性健康清洁(SPF)级的SD 大鼠[北京维通利华实验动物技术有限公司,实验动物的生产许可证号:SYXK(京)2015-0017]24只,体质量(237±13)g,置于北京中日友好医院医学动物实验动物房饲养[合格证号:SYXK(京)2005-0019;伦理审批单位:华北理工大学;动物实验研究的伦理审批号:LAEC-NCST-2017015]。动物模型的制备:① UUO模型组(U组):结扎大鼠左侧的输尿管两端,并剪断中间的输尿管;② 假手术组(S组):与UUO模型组方法相同,唯一区别是只分离左侧输尿管,并不结扎及剪断;③ UUO+QDPR空载组(C组):与UUO模型组方法相同,区别是在分离左侧输尿管后,沿着输尿管逆行注射病毒滴度为1.0×107U过表达QDPR空载慢病毒50 μl,然后用丝线结扎注射口的上方防止病毒流下,结扎输尿管两端,剪断中间的输尿管;④UUO+QDPR过表达组(Q组):与UUO+QDPR空载组方法相同,唯一区别为注射的病毒是过表达QDPR的慢病毒。造模后常规饲养,分别在7、14 d每组各处死3只。

1.3 免疫组化与Masson染色造模7、14 d后,取大鼠左侧肾脏做石蜡切片,然后进行免疫组化及Masson染色,最后在400倍的显微镜下观察,随机选10个不重复的视野,用Image J分析。

1.4 Western blot检测Western blot分别检测α-SMA、QDPR、ECa和Beclin1的表达水平。取大鼠左侧肾组织,液氮研磨后加入RIPA裂解液提取蛋白。Bradford法测定蛋白浓度,统一稀释到3 000 μg/ml,通过SDS-PAGE电泳每组跑15 μg蛋白,半干转到NC膜,5%牛奶室温封闭2 h,一抗[α-SMA(1 ∶1 000)、QDPR(1 ∶1 000)、ECa(1 ∶1 000)、Beclin1(1 ∶1 000)]室温孵育2 h,TBST洗膜,二抗(山羊抗兔1 ∶3 000)室温孵育2 h,TBST洗膜,最后显影,使用Image J分析条带的灰度值,然后计算各蛋白目的条带与内参的比值。

2 结果

2.1 UUO模型存在肾脏纤维化单侧输尿管结扎构建UUO模型(见图1),通过Masson和COL Ⅰ染色以及Western blot检测纤维化因子ECa和α-SMA的表达情况。Masson染色结果显示:UUO模型7 d组(U7)中的胶原纤维高于S模型7 d组(S7)(t=-19.596,P<0.001),UUO模型14 d组(U14)中的胶原纤维高于S模型14 d组(S14)(t=-6.552,P<0.001);COL Ⅰ染色显示:U7组中的COL Ⅰ的含量高于S7组(t=-11.351,P<0.001),U14组中的COL Ⅰ的含量高于S14组(t=-4.939,P<0.01);且,与S7组比较,U7组中ECa含量降低(t=7.387,P<0.05),α-SMA含量升高(t=-3.058,P<0.05);与S14组比较,U14组中ECa含量降低(t=7.866,P<0.01),α-SMA含量升高(t=-7.98,P<0.01)。见图2。

图2 Masson和COL Ⅰ染色以及Western blot检测UUO模型中的纤维化水平

2.2 UUO模型中QDPR表达肾脏免疫组化和Western blot检测了QDPR的表达情况。免疫组化结果显示:与S7组比较,U7组中的QDPR表达水平降低(t=27.256,P<0.001);与S14组比较,U14组中的QDPR表达水平降低(t=18.499,P<0.001)。Western blot结果显示:U7组(t=20.897,P<0.001)和U14组(t=8.301,P<0.01)中QDPR含量均低于S组。见图3。

图3 免疫组化染色和Western blot检测QDPR在肾纤维化中的表达情况

2.3 过表达QDPR基因的UUO模型的构建C7组(慢病毒对照7 d组)和Q7组(QDPR慢病毒过表达7 d组)中慢病毒标签ZsGreen均有表达;C14组(慢病毒对照14 d组)和Q14组(QDPR慢病毒过表达14 d组)组中ZsGreen亦有表达,提示慢病毒感染肾脏成功。免疫组化染色QDPR的结果显示:与C7组比较, Q7组中QDPR的表达差异无统计学意义(t=1.105,P=0.331);而与C14比较,Q14中QDPR染色的表达面积增加(t=-34.138,P<0.001)。Western blot结果显示:与C7组比较, Q7组中QDPR的表达差异无统计学意义(t=1.022,P=0.365);与C14比较,Q14中QDPR的表达增加(t=-7.061,P<0.01)。结果提示慢病毒在输尿管逆行注射后7 d已有表达,但未增高,14 d过表达组中QDPR显著增高。见图4。

图4 免疫组化染色和Western blot检测QDPR模型的制备情况

2.4 过表达QDPR对UUO诱导的大鼠肾间质纤维化的影响Masson染色显示:与C14组比较,Q14组的胶原纤维面积降低(t=6.811,P<0.01);COL Ⅰ染色显示:与C14组比较,Q14组的COL Ⅰ染色面积降低(t=4.643,P<0.05);Western blot检测显示:与C14组比较,Q14组中的ECa蛋白的表达水平增高(t=-10.280,P<0.05),α-SMA表达水平降低(t=2.922,P<0.05)。见图5。

图5 Masson、COL Ⅰ染色和Western blot检测过表达QDPR的UUO模型中的纤维化水平

2.5 过表达QDPR对Beclin1蛋白的表达的影响与S14比较,U14组中Beclin1蛋白的表达水平升高(t=-3.272,P<0.05);过表达QDPR后,与C14组比较,Q14组中Beclin1蛋白的表达水平降低(t=10.404,P<0.001)。见图6。

图6 Western blot检测Beclin1表达水平

3 讨论

肾间质纤维化是各种终末肾病发展到终末肾功能衰竭的终末途径[11-12],已成为危害人类生命健康的公共卫生问题。深入认识肾脏纤维化的发病机制,对肾脏疾病的预防、诊断和治疗具有重要的意义。

研究[4-5]发现,QDPR在体外研究中有一定的抗肾脏纤维化作用,可能与自噬密切相关。过表达QDPR基因能减少在纤维化中有重要作用的TGF-β1的表达[4],提示其在肾间质纤维化中发挥着重要的作用。本课题开展了过表达QDPR对肾间质纤维化影响的体内研究, UUO模型肾脏出现了纤维化,并且在UUO模型中发现QDPR含量降低,而与自噬密切相Beclin1的表达增高,提示QDPR和Beclin1可能在肾脏纤维化中有重要作用。为进一步研究QDPR在肾间质纤维化中的作用和机制,本研究用输尿管逆行注射的方法,制备过表达QDPR及其空载对照UUO模型,探究过表达QDPR对肾间质纤维化的影响及其可能机制。结果显示,C组与Q组中慢病毒标签ZsGreen均有表达,提示模型制作成功。免疫组化染色和Western blot检测显示QDPR在7 d表达并未表达增加,而14 d表达明显升高,提示慢病毒介导的基因表达需要超过1周才能充分表达。通过Masson染色及检测抗纤维化相关因子ECa的表达水平,发现过表达QDPR可降低胶原纤维并增加ECa的表达,表明过表达QDPR可以抑制UUO模型的肾间质纤维化。

为了进一步研究QDPR抑制UUO诱导的肾间质纤维化的作用机制,本研究检测了QDPR基因过表达的UUO模型中Beclin1的表达情况,发现过表达QDPR后Beclin1表达降低。众所周知,Beclin1是自噬发生的关键分子[10,13],在肾脏纤维化的进展中扮演重要角色[7]。据报道,在UUO肾间质纤维化的发病过程中自噬增强,进而诱导肾小管萎缩和分解,从而促进纤维化[9]。本研究中也发现Beclin1蛋白在UUO模型中表达增高,与前人观测结果一致。而过表达QDPR基因降低了Beclin1的表达,提示QDPR基因可能通过调控Beclin1的表达,进而改善肾间质纤维化。

综上所述,UUO模型中QDPR表达降低,Beclin1表达增加,纤维化增强,而过表达QDPR可抑制UUO诱导的肾间质纤维化,过表达QDPR能降低Beclin1表达,提示QDPR基因可能通过调控Beclin1的表达进而改善肾间质纤维化。

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