SPARCL1基因多态性与动脉粥样硬化遗传易感相关性分析

2023-06-07 08:05陈心严陈婷婷朱华庆程筱雯
安徽医科大学学报 2023年5期
关键词:遗传位点年龄

陈心严,程 煦,陈婷婷,王 华,张 敏,朱华庆,程筱雯

全球疾病负担报告[1]显示,由动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)引起的心脑血管疾病是现代社会威胁人类健康的首要原因。AS的发生原因较复杂,包括环境和遗传因素等[2-4]。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)构成90%以上人类基因组遗传变异,目前已发现很多与AS有关联的易感基因位点[5]。富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白类似蛋白1(secreted protein acidic and rich in cysteine-like 1,SPARCL1)是一种胞外基质蛋白,具有抗黏附、参与细胞增殖和迁移的功能[6]。相同的组织中,SPARCL1在疾病状况下表达有所变化。SPARCL1在前列腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、结直肠癌等多种癌症中表达下调,认为SPARCL1可能有抑癌作用[7-10]。目前尚未见SPARCL1与AS关系的文献报道,也鲜有关于SPARCL1基因多态性的研究。该研究拟通过病例对照研究,分析SPARCL1在AS患者和健康对照者中的表达情况及SPARCL1的SNP位点(rs7695558和rs1049539)与AS的相关性,探讨SPARCL1在AS发生发展过程中的可能作用,为AS的诊疗研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 病例资料选取安徽医科大学第一附属医院2019年12月—2020年6月收治的209例AS患者为研究对象,同一时期的208例健康体检者为对照组。随机选择其中51例AS患者和年龄性别相匹配的50例健康体检者的全血用于提取DNA。后续免疫组化实验所用冠状动脉组织源自安徽医科大学第一附属医院病理中心的临床解剖组织标本(10例)。所有AS的诊断均经临床确立。对照组经临床检查排除心脑血管疾病,且肝肾功能正常,与病例组年龄、性别相匹配。本研究所选取的研究对象与健康体检者均来自安徽省。

1.2 方法

1.2.1标本采集与DNA提取 采集空腹静脉血,全血用于提取DNA,促凝血离心分离后收集的血清用于酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)。严格按照试剂盒的说明书,从全血标本中提取基因组DNA。使用NanoDrop one(美国Thermo公司)检测DNA含量,样品DNA的A260/A280在1.8~2.0之间时,认为已达到所要求的纯度。

1.2.2ELISA试验 严格按照人SPARCL1酶联免疫分析试剂盒(上海江莱生物科技有限公司)的说明书操作。酶标板设置标准品孔、样本孔、空白孔(样本孔设置3个复孔),经加样、加酶、温育、洗涤、显色、终止、测定等步骤后,用酶标仪读取各孔吸光度值,计算样品浓度。

1.2.3免疫组织化学 3 μm厚的石蜡组织切片经65 ℃烤片2 h后脱蜡水化,并在柠檬酸钠缓冲液(10 mmol/L,pH 6.0)中微波加热以修复抗原。然后加入适量内源性过氧化物酶阻断剂室温阻断10 min,用PBS缓冲液冲洗3 min×3次,然后将切片与多克隆抗SPARCL1抗体(proteintech,武汉三鹰生物技术有限公司)以1 ∶200的稀释度在37 ℃温箱孵育1 h,PBS缓冲液冲洗3 min×3次,再滴加酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物室温孵育20 min,PBS缓冲液冲洗3 min×3次,最后进行显色反应。

1.2.4SNP基因分型 在LightCycler480 荧光定量PCR仪上通过高分辨率熔解曲线分析(high resolution melting,HRM)对样本进行基因分型。PCR在96孔板中以20 μl的体积进行,包括10~150 ng的DNA,2 mmol/L的每种引物,2.5 mmol/L的MgCl2,水和LightCycler480高分辨率熔解预混液。 按照以下反应条件进行:95 ℃ 10 min;95 ℃ 30 s,45个循环;58 ℃ 30 s;72 ℃ 30 s。 通过在70~97 ℃以每1 ℃ 25次采集的速率获得HRM曲线数据。AA和TT表示野生纯合基因型,AG和TC表示杂合突变基因型,GG和CC表示纯合突变基因型。

2 结果

2.1 SPARCL1 在血清中的表达情况病例组和对照组年龄、性别差异均无统计学意义(P>0.05);但AS患者的SPARCL1血清表达水平低对照组(Z=-2.916,P=0.004)。见表1。

表1 SPARCL1在病例组和对照组中血清表达水平

2.2 SPARCL1血清水平和AS发病风险关联的分层分析从以上AS病例人群中筛选出有AS发病风险因素数据的人群,420 ng/ml为该组人群SPARCL1血清水平的中位数,以420 ng/ml为分组切点,比较两组研究对象的年龄、性别、心血管危险因素等指标,结果显示SPARCL1水平与患者年龄(P=0.027)、舒张压有关(P=0.008),与SPARCL1血清水平低的患者比较,SPARCL1水平高的患者年龄更高且舒张压更低。见表2。

表2 SPARCL1不同水平和AS发病风险因素的组间比较

2.3 SPARCL1在血管组织中的表达情况免疫组化结果显示,冠状动脉组织中粥样硬化病变部位的SPARCL1表达水平增高,以泡沫细胞表达为主。见图1。

图1 免疫组化检测SPARCL1在AS患者冠状动脉组织中的表达情况

2.4 SPARCL1基因SNP位点rs7695558、rs1049539与AS易感性的关联性研究从209例AS患者和208例健康体检中随机选择其中51例AS患者和年龄性别相匹配的50例健康体检者,收集全血提取DNA后通过HRM对SPARCL1的两个SNP位点rs7695558、rs1049539进行基因分型。rs7695558多态性型别为AA、AG、GG,在对照组中的分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡。病例组中AA、AG、GG的发生频率分别为17.65%、52.94%、29.41%;在对照组中,相应的数据分别为10.00%、40.00%、50.00%。经χ2检验,病例组和对照组关于rs7695558的基因分布的差异无统计学意义(χ2=4.676,P=0.097)。rs1049539多态性型别为TT、TC、CC,在对照组中的分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡。病例组中TT、TC、CC的发生频率分别为47.06%、47.06%、5.88%;在对照组中,相应的数据分别为52.00%、44.00%、4.00%。经χ2检验,病例组和对照组关于rs1049539的基因分布的差异无统计学意义(χ2=0.435,P=0.848)。对于rs7695558,在隐性遗传模型中,含A和不含A的基因分布有差异,不含A等位基因(GG)的患者比含A等位基因(AA+AG)的患者的AS发病风险低,OR=0.417,95%CI:0.184~0.945,在10%的置信水平上显著(P=0.034)。病例组和对照组的rs1049539,在共显性、隐性、显性遗传模型差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 两组SPARCL1基因SNP位点rs7695558(A/G)和rs1049539(T/C)基因型分布情况

3 讨论

AS是一种脂质驱动的慢性炎症性疾病,其发病原因复杂,包括遗传及环境因素[11],SNP作为第3代遗传标记广泛存在于各类物种中,成为个体差异化和疾病发生发展的基础。SPARCL1基因位于人类染色体4q22~25,该基因包括11个外显子和10个内含子[12],包含多个SNPs,其中rs7695558为内含子突变,rs1049539为外显子突变。先前有研究[13]报道rs7695558与阿尔兹海默患者脑中SPARCL1低表达有关,表明SPARCL1在神经炎症中有一定作用。SPARCL1在血管炎症中是否发挥作用尚不清楚,国内外尚未报道相关文献。SPARCL1基因的编码产物为SPARCL1蛋白,本研究中,通过ELISA检测发现AS患者和对照组血清的SPARCL1含量有差异,结果AS患者的SPARCL1水平低于对照组,预示SPARCL1蛋白可能有血管保护作用。随后,以血清SPARCL1浓度420 ng/ml为分组切点,根据患者年龄、性别、心血管危险因素进行分层分析,结果表明SPARCL1水平与患者年龄、舒张压有关,与SPARCL1血清水平低的患者比较,SPARCL1水平高的患者年龄更高且舒张压更低,进一步表明SPARCL1可能是一种潜在的血管保护因子,但患者的性别、其他心血管危险因素与SPARCL1无明显相关,后续实验会扩大样本量以及纳入更多的血管危险因素进行分析。免疫组化实验结果提示SPARCL1蛋白在AS患者冠状动脉组织中粥样硬化病变部位表达水平升高,主要表达在泡沫细胞。结合前述血清SPARCL1蛋白检测结果分析,可能的原因是SPARCL1蛋白在AS发生发展过程中由于某种机制进入粥样硬化病变部位的含量增高导致其在血清中的含量下降。

本研究中,SPARCL1的两个SNP位点rs7695558(A/G)和rs1049539(T/C)在病例组和对照组中的基因分布差异均无统计学意义。在不同的遗传模型中发现对于rs7695558,在隐形遗传模型中,含A和不含A的基因分布有差异,不含A等位基因(GG)的患者比含A等位基因(AA+AG)的患者的AS发病风险低,OR=0.417,95%CI:0.184~0.945,在10%的置信水平上显著。对于rs1049539,在共显性、隐性、显性遗传模型中均未见病例组、对照组中的基因型分布有明显差异。

综上所述,本研究首次在中国安徽人群中鉴定了位于人类SPARCL1基因内含子内的与AS风险相关的新易感位点rs7695558,同时提示SPARCL1可能作为血管保护因子发挥了抗AS的作用。样本量较小为本研究的不足,课题组后续实验正在纳入更多的血管危险因素及其他地区的人群,扩大样本量验证并进一步在细胞水平及模式动物水平探讨SPARCL1抗AS的具体分子机制,以期评估SPARCL1成为AS诊疗新靶点的可能性。

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