王 文,陈新宇,黄兹艺,邓杨柳,崔红旺
骨折愈合是一个复杂且漫长的过程,多种生长因子和细胞炎症因子参与骨折的愈合过程,负责调节细胞活化和成骨细胞增殖[1-3]。研究[4]发现,NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor pyrin domain-associated protein 3,NRLP3)炎症小体不仅能激活炎症反应而且还参与了骨质疏松进展的调控,在延迟骨折愈合的过程中扮演重要角色。然而,其上下游的调控机制并不清楚。长非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是一类大于200个核苷酸的非编码转录本家族[5],通过调节Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)和炎症小体密切参与骨折愈合的调控[6-8]。同源框D基因簇反义生长相关的长非编码RNA(homeobox D gene cluster antisense growth-associated long noncoding RNA,HAGLR)是一种关键的LncRNA[9-11]。已知HAGLR在股骨颈骨折中表达降低[12],但对胫骨骨折(tibial fracture,TF)的调控作用仍不清楚。该研究拟建立TF模型,探讨HAGLR对骨折的愈合作用和机制。
1.1 材料
1.1.1主要试剂 小鼠成骨细胞MC3T3-E1购于武汉普诺赛生命科技有限公司。DMEM培养基购于美国GIBCO公司;胎牛血清购于美国Merck Millipore公司;沉默HAGLR的阴性对照(si-NC)、沉默HAGLR的小干扰RNA载体(si-HAGLR)、pcDNA3.1空载体(pcDNA-null)、pcDNA3.1-HAGLR过表达载体(pcDNA-HAGLR)、短发夹RNA载体阴性对照(sh-NC)、沉默RUNX2的短发夹RNA载体(sh-RUNX2)构建于上海吉玛制药技术有限公司;NLRP3炎症小体抑制剂MCC950购于美国MCE公司;Lipofectamine 2000购于美国Thermo Fisher Scientific公司;CCK-8试剂盒、TUNEL染色试剂盒、RIPA 裂解缓冲液购于上海碧云天生物技术有限公司;TRIzol试剂购于美国Thermo Fisher Scientific公司;TransScript和cDNA合成试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司;Universal SYBR Green Fast qPCR Mix Kit购于美国ABclonal公司;GAPDH购于美国Cell Signaling Technology公司;HRP标记的亲和山羊抗兔鼠IgG(H+L)二抗购于美国Protein Tech Group公司;PVDF购于上海碧云天生物技术有限公司;RUNX2一抗、 p-RUNX2一抗、胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)一抗购于美国 Cell Signaling Technology公司;NLRP3、Caspase1、ASC、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的一抗购于北京生工生物工程有限公司。
1.1.2实验动物 100只成年雄性C57BL/6小鼠,10周龄,体质量(31.25±1.66) g,购于海南药物研究所有限责任公司(许可证号:SCXK2020-0007)。所有小鼠均在受控温度(21~23 °C)下喂养,12 h/12 h光/暗周期模拟白天/夜晚变化,并自由获取食物和水。本研究中使用的所有动物都按照机构动物护理指南接受了人道护理。所有手术和实验程序均通过海南医学院第一附属医院伦理委员会批准。
1.2 方法
1.2.1动物分组与建模 TF小鼠建模方法按文献[13]提供的方法,用1%戊巴比妥钠按1 ml/kg腹腔注射麻醉小鼠后,备皮、消毒小鼠右下肢,在小鼠右侧膝关节下切开约0.5 cm纵行切口,由膑腱处插入22 G/0.41 mm 髓内固定针,于胫骨中上1/3处分离肌肉及筋膜,使用锯片锯断胫骨骨干后立即使用0.9%生理盐水冲洗胫骨表面,再将髓内固定针完全插入并对合。逐层缝合切口,制成TF模型小鼠。将20只小鼠按随机数表法分为健康组(Normal组,正常饲养,n=10)和TF组(n=10)。另,将80只雄性C57BL/6小鼠在TF术后10 d,随机分为8组进行治疗:pcDNA-null+TF组[pcDNA-null以20 μg/(kg· d)静脉注射];pcDNA-HAGLR+TF组[pcDNA-HAGLR以20 μg/(kg· d)静脉注射];sh-NC+TF组[sh-NC以20 μg/(kg· d)静脉注射];sh-RUNX2+TF组[sh-RUNX2以20 μg/(kg· d)静脉注射];sh-NC+pcDNA-HAGLR+TF组[sh-NC以20 μg/(kg· d)静脉注射,pcDNA-HAGLR以20 μg/(kg· d)静脉注射];sh-RUNX2+pcDNA-HAGLR+TF组[sh-RUNX2以20 μg/(kg· d)静脉注射,pcDNA-HAGLR以20 μg/(kg· d)静脉注射];saline+pcDNA-HAGLR+TF组[联合注射,其中saline以100 μl/(kg· d)静脉注射,pcDNA-HAGLR以20 μg/(kg· d)静脉注射];MCC950+pcDNA-HAGLR+TF组[联合注射:MCC950以20 mg 100 μl/(kg· d)静脉注射,pcDNA-HAGLR以20 μg/(kg· d)静脉注射]。每组10只小鼠,连续注射4 周后分离全长胫骨并称湿重。随后将各组小鼠的胫骨组织保存于-80 ℃冰箱中。
1.2.2MC3T3-E1细胞培养 使用含10%胎牛血清和1%青-链霉素的DMEM培养基在37 ℃下,含95%空气和5% CO2的培养箱中培养MC3T3-E1细胞。细胞每2 d换液一次,取处于对数生长期的细胞用于后续实验。
1.2.3MC3T3-E1细胞转染si-HAGLR 采用Lipofectamine 2000将10 nmol/L si-NC或si-HAGLR转染入MC3T3-E1细胞中。24 h后收集细胞用于qPCR检测。
1.2.4qPCR检测HAGLR、BALP、骨钙素和RUNX2的表达 收集si-NC组和si-HAGLR组细胞用于检测HAGLR、骨碱性磷酸酶(bone alkaline phosphatase,BALP)、骨钙素的表达。收集Normal组、TF组、pcDNA-null+TF组、pcDNA-HAGLR+TF组、sh-NC+TF组、sh-RUNX2+TF组、sh-NC+pcDNA-HAGLR+TF组、sh-RUNX2+pcDNA-HAGLR+TF组骨组织(用于检测HAGLR和RUNX2的表达,骨组织研磨后浸入液氮粉化)。使用Trizol法提取待测组织或细胞的总RNA。用DNase I处理1 μg总RNA,进行逆转录。并根据制造商的说明,使用SYBR®Green PCR进行qPCR分析。qPCR引物序列见表1。在96孔光学反应板中进行40个循环进行扩增,1个循环中94 °C变性5 s,63 °C退火30 s,72 °C延伸60 s。以GAPDH作内参基因,2-ΔΔCt法计算分析目的基因的表达水平。
表1 qPCR引物序列
1.2.5CCK-8检测MC3T3-E1细胞的增殖 根据生产商提供的说明,将转染si-NC或si-HAGLR的MC3T3-E1细胞接种至96孔板中,培养24、48、72、96 h后去除培养液,在避光下向每孔加入100 μl 含10% CCK-8溶液的DMEM完全培养液,37 ℃孵育4 h后终止培养,室温下置于摇床振荡5 min。在酶标仪上测定450 nm 处吸光度值。实验重复3次。
1.2.6TUNEL检测MC3T3-E1细胞的凋亡 根据生产商提供的说明,于细胞爬片上培养MC3T3-E1细胞并转染si-NC或si-HAGLR,培养24 h后去除培养液,在避光下向每孔加入50 μl TUNEL试剂盒工作液,并继续孵育12 h。DAPI核染15 min后加入抗荧光淬灭液封片,荧光显微镜上观察拍照。细胞凋亡率=TUNEL阳性细胞/总细胞×100%。
1.2.7Western blot检测RUNX2和NLRP3炎症小体相关蛋白的表达 收集各组细胞和各组小鼠股骨组织,将组织匀浆后,在冰上于RIPA 裂解缓冲液中裂解细胞和组织。BCA法测定细胞与组织中的蛋白浓度。取50 μg蛋白样品,SDS-PAGE凝胶进行分离。随后,转移蛋白到PVDF上。将PVDF膜用5%脱脂奶粉封闭后,加入RUNX2和p-RUNX2、NLRP3、Caspase1、ASC、IL-1β、IGF-1一抗,并在在4 ℃下孵育过夜。次日,加入HRP标记二抗在室温下孵育2 h。随后用增强的化学发光试剂显色,并使用Image J软件进行分析。
1.2.8微计算机断层扫描(micro-computed tomography,micro-CT)测量小鼠骨痂骨体积(mouse bone volume,MBV) 近端干骺端区域内的骨形态测量使用micro-CT对胫骨进行量化。在背腹方向扫描250个切片(厚度13 μm)。使用三角测量算法进行骨骼的三维重建。测量小鼠骨痂骨尺寸,并生成MBV值。
2.1 TF小鼠骨折组织中HAGLR的表达图1A为TF后不同周的TF小鼠的X光片。在第1周和第2周无骨愈合特征,第4周出现了骨愈合组织和骨折形态,这表明TF模型小鼠造模成功。qPCR法检测结果显示:与Normal组比较,HAGLR在TF组小鼠骨组织中表达下调[(7.05±1.21)vs(2.61±0.49),t=8.662,P=0.031],差异有统计学意义,见图1B。
图1 TF模型观察及骨折组织中HAGLR的表达
2.2 敲低HAGLR诱导小鼠成骨细胞的凋亡和NLRP3炎症小体的表达qPCR结果显示:与si-NC组比较,si-HAGLR组MC3T3-E1细胞中HAGLR表达显著降低[(1.00±0.12)vs(0.46±0.03),t=13.216,P=0.002,图2A]。CCK-8实验结果显示:与si-NC组比较,si-HAGLR组MC3T3-E1细胞的增殖活力明显降低(F=9.662,P=0.014,图2B)。TUNEL染色结果显示:与si-NC组比较,si-HAGLR组MC3T3-E1细胞的凋亡率显著升高[(4.12±0.43)%vs(8.51±0.92)%,t=11.602,P=0.003,图2C)]。随后,通过qPCR检测BALP mRNA和骨钙素mRNA的表达水平来评估HAGLR对成骨细胞活性的调节作用,结果显示:与si-NC组比较,si-HAGLR组MC3T3-E1细胞BALP和骨钙素的mRNA水平均明显下调(BALP:t=15.236,P=0.002;骨钙素:t=13.251,P=0.003,图2D、E)。Western blot检测NLRP3炎症小体相关蛋白NLRP3、Caspase1、ASC、IL-1β表达,结果显示:与si-NC组比较,si-HAGLR组MC3T3-E1细胞中NLRP3、Caspase1、ASC、IL-1β蛋白表达均明显升高(NLRP3:t=9.503,P=0.035;Caspase1:t=15.446,P=0.003;ASC:t=10.305,P=0.007;IL-1β:t=8.528,P=0.022,图2F~J)。
图2 敲低HAGLR诱导小鼠成骨细胞的凋亡和NLRP3炎症小体表达的影响
2.3 HAGLR调控RUNX2的表达在MC3T3-E1细胞中,与si-NC比较,si-HAGLR组中RUNX2的mRNA和蛋白水平均显著降低(t=17.089、12.887,P=0.001、0.019,图3A、B),且p-RUNX2蛋白水平也降低(t=12.007,P=0.008,图3C)。在小鼠骨组织中,与Normal组比较,RUNX2的mRNA在TF组织中的表达水平明显降低(t=7.669,P=0.025,图3D)。在小鼠体内沉默RUNX2或者过表达HAGLR,qPCR结果显示:与pcDNA-null组比较,pcDNA-HAGLR组的HAGLR和RUNX2 mRNA表达水平均明显升高(HAGLR:t=12.606,P=0.003;RUNX2:t=14.662,P=0.002)。但与sh-NC组比较,sh-RUNX2组的HAGLR水平变化差异无统计学意义(t=2.544,P=0.179),RUNX2 mRNA表达明显降低(t=10.570,P=0.016),见图3E、F。
图3 HAGLR对RUNX2表达的影响
2.4 沉默RUNX2逆转HAGLR对小鼠骨组织愈合的促进作用各组TF造模4周后骨组织愈合指标的比较结果显示:与Normal组比较,TF组、pcDNA-null+TF组、pcDNA-HAGLR+TF组、sh-NC+pcDNA-HAGLR+TF组和sh-RUNX2+pcDNA-HAGLR+TF组的MBV(F=116.332,P=0.002)、全长胫骨湿重(F=103.899,P=0.006)、IGF-1蛋白表达水平(F=96.177,P=0.018)均明显升高。与TF组比较,pcDNA-null+TF组的上述指标变化差异无统计学意义(P>0.05)。与pcDNA-null+TF组比较,pcDNA-HAGLR+TF组和sh-NC+pcDNA-HAGLR+TF组的MBV、全长胫骨湿重、IGF-1蛋白表达水平均明显增加(P<0.05)。而与sh-NC+pcDNA-HAGLR+TF组比较,sh-RUNX2+pcDNA-HAGLR+TF组MBV、全长胫骨湿重、IGF-1蛋白表达均降低(P<0.05)。见图4。
图4 沉默RUNX2逆转HAGLR对小鼠骨组织愈合的促进作用
2.5 抑制NLRP3炎症小体促进HAGLR对小鼠骨组织的愈合作用用NLRP3炎症小体选择性抑制剂MCC950抑制NLRP3炎症小体的表达后比较各组小鼠骨组织愈合指标。结果显示:与Normal组比较,TF组、pcDNA-null+TF组、pcDNA-HAGLR+TF组、saline+pcDNA-HAGLR+TF组和MCC950+pcDNA-HAGLR+TF组的MBV(F=254.889,P=0.001)、全长胫骨湿重(F=90.065,P=0.022)、IGF-1的蛋白表达水平(F=108.254,P=0.005)差异均有统计学意义;与pcDNA-null+TF组比较,pcDNA-HAGLR+TF组和saline+pcDNA-HAGLR+TF组的MBV、全长胫骨湿重、IGF-1的蛋白表达水平差异均有统计学意义(P<0.05);与saline+pcDNA-HAGLR+TF组比较,MCC950+pcDNA-HAGLR+TF组MBV、全长胫骨的湿重、IGF-1的蛋白相对表达量均明显增加(P<0.05)。见图5。
图5 抑制炎性小体促进HAGLR对小鼠骨组织愈合的促进作用
本实验在体内外水平探究了HAGLR调控TF愈合的潜力,结果表明HAGLR在TF小鼠骨组织中表达降低,沉默HAGLR后小鼠成骨细胞中成骨标志物和RUNX2的表达均降低,但细胞凋亡率和NLRP3炎症小体表达水平增加。在TF小鼠中过表达HAGLR后不仅可促进RUNX2的表达增加,还明显改善了MBV、全长胫骨湿重和IGF-1的蛋白表达量。沉默RUNX2则可明显抑制过表达HAGLR对TF小鼠MBV、全长胫骨湿重、IGF-1表达的上调功能,而抑制NLRP3炎症小体则进一步促进了TF小鼠MBV、全长胫骨湿重、IGF-1的表达,提示HAGLR在TF骨折愈合中扮演重要角色。
既往研究[11]报道称HAGLR在股骨骨折组织中下调,且可通过调控细胞增殖和凋亡参与调控骨折的愈合。本研究结果同样表明,HAGLR在TF组织中的表达降低,且过表达HAGLR可以明显促进骨痂生长,而沉默HAGLR可以明显抑制前成骨细胞的增殖并促进凋亡,提示过表达HAGLR可能具有促进骨折愈合的功能。
影响骨折愈合的主要因素为骨折端的血供不良,导致骨营养缺乏。RUNX2是促进骨折愈合的关键标志物,其可通过激活骨形态发生蛋白2通过Smad信号通路诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,从而促进骨折愈合[14]。已有研究发现LncRNA KCNQ1OT1可上调RUNX2和骨钙素[15],而且lncRNA MEG3也具有类似效果[16],表明LncRNA可作为一种潜在的成骨细胞分化的重要分子。有研究[17]报道RUNX2表达与骨形成密切相关,并且RUNX2的表达水平升高代表骨折愈合增加。本研究结果观察到TF骨组织中RUNX2表达降低,而过表达HAGLR则可以恢复RUNX2和p-RUNX2的表达,但沉默HAGLR则可以抑制成骨细胞中的RUNX2和p-RUNX2,表明HAGLR会促进骨折愈合,与RUNX2的调控密切相关。研究[17]发现,骨骼生长刺激因子IGF-1的缺乏对骨骼结构发育具有负面影响,如在快速生长和骨骼成熟的青春期,循环系统中IGF-1的含量明显增加,而敲除IGF-1表达则能抑制骨骼的生长。本研究在体内观察到TF小鼠过表达HAGLR不仅导致MBV和全长胫骨重量的明显增加,且过表达HAGLR也可导致IGF-1的表达量明显增加;而在过表达HAGLR基础上沉默RUNX2则可以明显抑制过表达HAGLR对TF小鼠MBV、全长胫骨湿重、IGF-1表达的上调功能,提示过表达HAGLR可能通过激活RUNX2促进TF的愈合。
研究[18]表明,特异性抑制NLRP3炎症小体可明显增加糖尿病诱导的骨折模型中的MBV、骨体积分数并抑制骨折组织中IFN-γ、TNF-α 和IL-6的表达,抑制小鼠NLRP3炎症小体还可以促进牙槽骨缺损的愈合,表明NLRP3炎症小体的抑制药可能是骨折愈合的潜在治疗药物。本研究发现沉默HAGLR后小鼠成骨细胞的凋亡率和NLRP3炎症小体均明显增加,在过表达HAGLR的基础上使用NLRP3炎症小体选择性抑制剂MCC950抑制NLRP3炎症小体的激活后TF小鼠的MBV、全长胫骨的湿重和IGF-1的蛋白相对表达量都明显增加,表明过表达HAGLR可通过抑制NLRP3炎症小体促进TF的愈合。
综上所述,HAGLR在TF中的表达明显降低,且其可通过促进RUNX2表达和抑制NLRP3炎症小体促进骨折愈合。本研究仍然存在一些局限性,如缺乏对小鼠骨折愈合过程中HAGLR分子机制深入探讨,下一步课题组将进一步开展研究探讨。