人参皂苷Rg1促进人牙龈成纤维细胞增殖、迁移及成骨分化的研究

张 昕,李长顺,刘 浩,朱绍跃,周 猛,冯 岩,张光东

人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts,HGFs)是牙周组织工程常用的种子细胞[1]。已证实HGFs具有多向分化的潜能,可在不同诱导条件下分化为骨细胞、平滑肌样细胞以及内皮样细胞等[2]。人参是一种传统中药材,人参皂苷Rg1(ginsenoside Rg1,GsRg1)是其主要活性成分之一,具有抗炎、抗氧化等功能[3]。研究[4]发现GsRg1可调控间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的增殖、分化、衰老、凋亡,从而影响机体组织修复。Yin et al[5]研究发现,GsRg1可促进牙周膜干细胞(periodontal membrane stem cells,PDLSCs)增殖,增加碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性及骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和骨钙素(osteocalcin,OCN)等蛋白的表达,从而促进PDLSCs的成骨向分化。然而GsRg1对HGFs增殖、迁移以及成骨机制的研究尚未见报道。因此,该研究探讨GsRg1对HGFs增殖、迁移的影响,并验证GsRg1对HGFs成骨方向分化的影响,初步探索其可能的作用机制,为GsRg1用于牙周组织修复再生及牙周病的治疗提供了实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂GsRg1单体(纯度98%,微科曼得生物工程有限公司);DMEM高糖培养基、DAPI染色试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);I型胶原蛋白酶、Dispase Ⅱ(美国Gibco公司);CCK-8试剂盒、Triton X- 100、正常山羊血清、青-链霉素双抗(微科曼得生物工程有限公司);Vimentin抗体、Cytokeratin17抗体、488荧光标记红色山羊抗兔子IgG(美国Proteintech公司);Transwell过滤器培养板(美国BD公司),倒置光学显微镜(日本Nikon公司);磷酸盐缓冲液(上海碧云天生物技术有限公司);0.25%胰酶细胞消化液(微科曼得生物工程有限公司);兔抗β-actin抗体、兔抗PI3K抗体、兔抗p-PI3K抗体、兔抗AKT抗体、兔抗p-AKT抗体(上海碧云天生物技术有限公司);兔抗OCN抗体,兔抗I型胶原蛋白(collagen-Ⅰ,COL-Ⅰ)抗体,兔抗OPN抗体(美国Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1HGFs的提取与培养 徐州医科大学附属口腔医院口腔颌面外科门诊选取18～22周岁健康成年患者因正畸需要拔除前磨牙或第三磨牙,已获得供者本人知情同意,牙齿无龋坏、牙髓炎、牙周炎等疾病,牙齿周围牙龈质地及色泽正常,无炎症肿胀。行拔除术前以75%乙醇充分消毒牙体周围组织,切取拔牙创周围的牙龈组织,立即置于含双抗的预冷DMEM中,迅速转移到实验室。

在超净工作台内,用含双抗的PBS冲洗3次后,将组织块剪成1～3 mm3的大小,采用胰酶消化法,37 ℃下水浴锅中消化组织2 h,然后加入含20%血清的DMEM培养液终止消化,离心去除上清液后再次加入含20%血清的DMEM培养液,吹打均匀后将细胞悬液放入培养皿中,置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养,每3 d换液1次。当细胞融合至80%～90%后,弃培养液,PBS清洗,用0.25%胰蛋白酶消化5 min得到细胞悬液,离心去上清夜,重新加入含20%血清的DMEM培养液重悬细胞,传代获得实验用细胞,取第3代HGFs进行实验。该项目由徐州医科大学附属口腔医院伦理委员会批准、审查(批准号:202009w014)。

1.2.2HGFs的免疫荧光鉴定 将第3代HGFs以3×104个/ml密度均匀接种于24孔板中的爬片上,待细胞铺满爬片约 60%时弃去培养液;用4%的多聚甲醛固定爬片15 min,干燥后PBS液洗涤;然后0.5%Triton X-100室温通透20 min;爬片上滴加正常山羊血清,室温封闭30 min以减少非特异性背景着色;加一抗[鼠抗人波形丝蛋白(Vimentin)抗体、鼠抗人细胞角蛋白(CK)抗体]4 ℃孵育过夜;次日复温30 min后加山羊抗兔二抗于37 ℃湿盒内避光孵育1 h;用DAPI处理30 min后PBS液冲洗3遍,封片。用荧光显微镜采集细胞图像。

1.2.3不同浓度GsRg1溶液配置 取20 mg GsRg1粉末,用含10% FBS的DMEM培养液配置浓度为100 mg/L的GsRg1溶液,然后按比例稀释,配成含0、6.25、12.5、25、50、100 mg/L的GsRg1、10%FBS的DMEM 培养液,长期低温密封保存。

1.2.4CCK-8法检测GsRg1对HGFs增殖的影响 取生长良好的第3代HGFs,配制浓度为4×104个/ml的单细胞悬液,以每孔100 μl接种于96 孔培养板中,置于37 ℃、5% CO2培养箱中预培养24 h,换液,每孔加入100 μl不同浓度(0、6.25、12.5、25、50、100 mg/L)的GsRg1,0 mg/L为阴性对照,每个浓度设5个复孔,置于37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养。分别于2、24 h后,按照CCK-8法说明书进行操作,每孔加入10 μl的CCK-8,将培养板在培养箱中孵育2 h,用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

1.2.5Transwell实验检测GsRg1对HGFs迁移的影响 取生长良好的第3代HGFs细胞,配制浓度为1×105个/ml的单细胞悬液,经血清饥饿12 h后,以每孔100 μl接种于Transwell上室,下室置入500 μl 1%胎牛血清α-MEM培养基,分别用0、6.25、12.5、25、50、100 mg/L GsRg1处理细胞,然后分别于6、8、12、24 h后将下室经甲醛固定30 min,0.1%结晶紫染色并在倒置显微镜下观察计数小室下表面的活细胞数。

1.2.6ALP活性检测 取生长良好的第3代HGFs细胞,经胰蛋白酶消化计数,将HGFs密度调整为2×104个/ml,接种在24孔板内,待细胞贴壁80%后,实验分组:实验组加入100 mg/L GsRg1处理,对照组0 mg/L GsRg1处理。培养4、7 d后,吸出原有培养基,PBS洗涤3次,接着用4%多聚甲醛固定30 min,PBS洗涤,随后每孔加入配制好的ALP显色剂避光染色30 min,PBS洗涤后用光学显微镜观察并拍摄图像。

为了检测ALP活性的定量表达,细胞培养4、7 d后,PBS冲洗,每孔加入100 μl 1%曲拉通 X-100,置于冰上裂解30 min,反复吹打后收集裂解液。裂解液置于冷冻离心机4 ℃温度下,以12 000 r/min的转速离心10 min,吸取上清液。根据BCA蛋白定量试剂盒的说明,测定上清液的总蛋白浓度,并根据ALP活性检测试剂盒的说明,计算样品的ALP活性。

1.2.7茜素红染色 取生长状态良好的第3代HGFs,胰蛋白酶消化计数后,将HGFs密度调整为2×104个/ml接种在6孔板中,待细胞贴壁生长至80%时,去除培养液,实验分组:对照组仅添加成骨诱导培养液(含10% FBS的α-MEM、0.05 μg/LL-抗坏血酸磷酸、10 mmol/L β-甘油磷酸、10 nmol/L地塞米松),实验组分别添加浓度12.5、100 mg/L GsRg1的矿化诱导培养液,分别培养14 d,吸去原培养液,PBS漂洗3遍。每孔加入1 ml的4%多聚甲醛固定40 min。吸去固定液,PBS洗涤。每孔加入1 ml茜素红染色液,染色5 min。吸去染色液,PBS反复漂洗至液体颜色不变红。室温烘干,倒置显微镜下观察并拍照记录各组培养皿表面钙结节的染色情况。采集图像后,6孔板每孔加入CPC处理10 min,收集液体样本,测定OD值。

1.2.8成骨相关基因表达的检测 将HGFs以2×104个/ml的密度接种在24孔板内。实验分组:实验组每孔加入2 ml含100 mg/L GsRg1的α-MEM进行培养,对照组每孔加入2 ml(0 mg/L GsRg1)α-MEM进行培养。在培养4、7 d后,吸出原有培养基,PBS洗涤3次,每孔内加入200 μl的Trizol裂解细胞,反复吹打后将裂解液收集至1.5 ml的EP管中。随后每管加入三氯甲烷抽提RNA,于冷冻离心机4 ℃温度下,以12 000 r/min的转速离心15 min,吸取上清液至EP管中。接着每管加入等量的异丙醇沉淀RNA,于冷冻离心机4 ℃温度下,以12 000 r/min的转速离心5 min,留沉淀。然后每管加入DEPC水配制的75%无水乙醇洗涤沉淀,于冷冻离心机4 ℃温度下,以12 000 r/min的转速离心5 min,沉淀洗涤3次。接着倒置EP管晾干沉淀,每管加入DEPC水来溶解沉淀,使用紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度。最后用逆转录试剂盒将RNA反转录为cDNA,用实时定量PCR试剂盒检测COL-Ⅰ、OCN和OPN基因的相对表达。实验中以GAPDH基因作为内参,各基因引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.9Western blot实验检测OPN、OCN、COL-Ⅰ蛋白表达 取生长良好的HGFs均匀铺于6孔板中,细胞培养箱培养至细胞贴壁生长至80%,实验分组:实验组100 mg/L GsRg1处理,对照组不做处理。分别在第7、14、21天收集蛋白样品。采用RIPA细胞裂解液冰上裂解15 min,在4 ℃、6 000 r/min条件下离心10 min,提取上清溶液,即为实验用蛋白样品。采用BCA法进行蛋白质定量,制备蛋白电泳样品。对两组蛋白样品电泳并转移至转膜上封闭2 h。孵育一抗:加入兔抗OCN抗体、兔抗COL-Ⅰ抗体、兔抗OPN抗体,在4 ℃环境下孵育过夜,PBS冲洗3次,清理残余一抗。孵育二抗:加入HRP标记的二抗(山羊抗兔IgG),室温孵育2 h,PBS冲洗3次。进行ECL化学发光法检测,显色后进行半定量分析。

1.2.10Western blot实验检测PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达 取生长良好的HGFs均匀铺于6孔板中,细胞培养箱培养至细胞贴壁生长至80%,实验分组:实验组100 mg/L GsRg1处理细胞4、8、12、24 h,对照组不做处理,相同培养条件下静置24 h。收集蛋白样品,按1.2.9 实验方法检测PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达情况。

2 结果

2.1 HGFs的分离与培养采集不同代次细胞,观察其在倒置显微镜下的图像(图1A、B)。观察到细胞生长良好,形态稳定,绝大多数呈梭形,胞质丰满,胞核位于细胞中央,呈圆形或椭圆形。细胞长满时,呈漩涡状分布,是HGFs的典型形态。

图1 分离和培养HGFs ×40

2.2 HGFs免疫荧光鉴定荧光显微镜下观察:细胞为长梭形或纺锤形,细胞核为圆形或椭圆形,Vimentin染色阳性(细胞核为蓝色,细胞胞浆为绿色,图2A1～3),CK染色阴性(细胞核为蓝色,细胞胞浆不显色,图2B1～3)。

图2 HGFs的免疫荧光鉴定 × 200

2.3 不同浓度GsRg1对HGFs增殖的影响HGFs中加入不同浓度的GsRg1培养 24 h,所测的吸光度值随GsRg1浓度的增高逐渐升高。6.25 mg/L GsRg1组吸光度值与对照组比较差异无统计学意义,其余4组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05,图3)。

图3 GsRg1对HGFs增殖的影响

2.4 GsRg1对HGFs迁移的作用Transwell实验结果显示,与对照组比较,HGFs中加入不同浓度的GsRg1培养后,穿膜细胞数量增多,而且细胞迁移能力随着GsRg1给药浓度升高而增强(图4)。

图4 GsRg1对HGFs迁移能力的影响 ×40

2.5 GsRg1对HGF的ALP表达作用ALP染色及ALP活性定量实验检测GsRg1 (100 mg/L)对HGFs的ALP表达的影响。ALP染色结果显示,实验组染色比对照组深。第4、7天,实验组 ALP活性均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01,图5)。

图5 GsRg1对HGFs ALP活性的影响 ×40

2.6 茜素红染色结果在光学显微镜下观察各组HGFs培养染色情况,结果显示实验组红染结节明显多于对照组。钙结节定量结果与茜素红染色一致,实验组吸光度值较对照组升高(P<0.01),且100 mg/L GsRg1的吸光度明显高于12.5 mg/L GsRg1 (P<0.01)。见图6。

图6 GsRg1对HGFs成骨能力的影响 ×40

2.7 qRT-PCR结果qRT-PCR 实验检测成骨相关基因(OPN、OCN、COL-Ⅰ)在第 7、14 天的相对表达水平。结果表明:不同组间OPN的表达差异有统计学意义(F=11.25,P<0.05),不同组间OCN的表达差异有统计学意义(F=40.77,P<0.05),不同组间COL-Ⅰ的表达差异有统计学意义(F=26.565,P<0.05)。与对照组比较,实验组明显上调了HGFs中成骨相关因子OPN、OCN、COL-Ⅰ的mRNA表达量,差异均有统计学意义(P<0.05,图7)。

图7 qRT-PCR检测成骨相关基因的表达

2.8 GsRg1对HGFs成骨相关蛋白表达Western blot法检测两组HGFs成骨相关蛋白表达。结果表明:与对照组比较,实验组HGFs成骨蛋白OPN、OCN、COL-Ⅰ的蛋白表达水平明显上调,差异有统计学意义(P<0.05, 图8)。

图8 GsRg1对HGFs成骨相关分子在蛋白水平的影响

2.9 GsRg1处理激活HGFs的PI3K/AKT的通路Western blot法检测两组HGFs的PI3K/AKT通路的蛋白表达情况。结果表明:实验组HGFs的p-PI3K、p-AKT两种蛋白表达水平随时间推移上调变化明显,差异有统计学意义(P<0.05,图9),而实验组HGFs的PI3K、AKT蛋白表达水平随时间推移无明显差异。

图9 GsRg1对HGFs PI3K/AKT通路蛋白表达的影响

3 讨论

牙周病可导致牙周附着丧失、牙槽骨破坏和吸收。牙周病治疗的主要目的在于促进牙周组织再生[6]。HGFs易于取材、定向增殖分化能力优异,在一定条件下具有成骨向分化能力,在牙周组织再生的研究中成为理想的种子细胞[7]。

本实验以HGFs为切入点,采用组织块法进行HGFs的体外分离培养,免疫荧光鉴定细胞抗Vimentin染色阳性、抗CK染色阴性说明细胞来源于结缔组织。不同浓度的GsRg1作用于HGFs后,CCK-8法和Transwell细胞迁移实验结果显示,GsRg1能够促进HGFs细胞的增殖、迁移能力。组织的修复和再生都离不开细胞增殖和迁移,这一实验结果预示着GsRg1在组织工程研究中的应用潜力。

ALP是成骨早期标志物,当细胞分化成骨时,ALP的活性明显提高,这一特性被广泛应用于验证细胞成骨能力的实验中[8-9]。有学者在GsRg1对小鼠骨髓干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)的研究中发现,与0 mg/L GsRg1比较,100 mg/L GsRg1作用于BMSCs后,ALP活性明显提高,说明有大量的成骨细胞形成;另有研究[10]发现,经过1 μmol/L浓度的GsRg1培养后,PDLSCs的 ALP 活性显著提高,说明GsRg1具有促进PDLSCs 成骨分化的能力。本实验中100 mg/L GsRg1作用于HGFs后,ALP活性明显增高,表明GsRg1对HGFs早期成骨分化具有促进作用。

钙结节是成骨晚期形成的一种标志物,茜素红染色结果显示实验组红染结节明显多于对照组,钙结节定量检测显示实验组吸光度值明显高于对照组,且100 mg/L GsRg1的吸光度值明显高于12.5 mg/L GsRg1,表明GsRg1具有促进HGFs晚期成骨分化的作用,且随着浓度的升高,促进作用增强。

OCN是成骨分化中期重要的标志物[11],可以用于检验成骨细胞活性。OPN是一种重要的骨基质蛋白,与骨的形成和矿化密切相关[12]。COL-Ⅰ是由成骨细胞分泌的骨基质中最主要的纤维胶原成分,可有效刺激细胞的黏附和成骨分化[13]。qRT-PCR和Western blot实验显示:与对照组比较,实验组的OCN、OPN、COL-Ⅰ mRNA和蛋白表达水平增高,说明100 mg/L GsRg1具有促进HGFs成骨分化的效果。

PI3K/Akt 信号通路与细胞生长、增殖、蛋白合成、新陈代谢和凋亡等生物活动密切相关[14]。研究[15]表明PI3K/AKT信号通路与骨生成和软骨内骨化密切相关,激活 PI3K/Akt 信号通路可促进 BMSCs、PDLSCs 的增殖和成骨分化,促进成骨相关因子 ALP、Runx2、OCN 等的表达。Western blot实验检测GsRg1作用于HGFs后的PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达,结果发现实验组p-PI3K/p-AKT蛋白表达水平随给药时间的延长而明显上升,而PI3K/AKT蛋白表达随时间推移无明显改变,可能的原因是成骨基因的蛋白水平表达升高,进而激活PI3K/AKT信号通路,从而推断GsRg1有可能通过激活PI3K/AKT信号通路达到促进HGFs成骨分化的作用。这一推论仍有待后续实验进一步完善论证。

综上所述,GsRg1可以提升HGFs增殖、 迁移以及成骨分化能力,其作用机制可能与PI3K/AKT信号通路的激活有关。本研究将为GsRg1在牙周组织再生工程中的应用提供参考,证实其在口腔医学领域有广阔的应用前景。但GsRg1促进HGFs成骨分化的作用机制是否与PI3K/AKT信号通路的激活有关仍需实验进一步证实。