JAK抑制剂托法替布治疗类风湿关节炎相关间质性肺病的实验研究

蒋 总,姚晓玲,唐 芳,马武开,兰维娅, 姚血明,安 阳, 刘正奇

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种多器官、多系统受累的免疫性疾病[1]。普通型间质性肺炎(usual interstitial pneumonia,UIP)是RA-间质性肺病(interstitial lung disease,ILD)中最常见的类型之一,也是RA死亡的主要原因之一[2]。目前RA-ILD的发病机制尚不清楚,且缺乏有效的治疗手段。因此,探索RA-ILD的发病机制及寻求有效治疗药物尤为重要。目前研究证实JAK信号通路与RA密切相关,相关药物已经批准用于临床[3]。临床中也发现托法替布(JAK抑制剂)不仅能有效缓解RA病情,还能缓解ILD影像学表现。已有研究[4]报道发现ILD与JAK信号通路有明显的相关性,但无明确的证据显示JAK信号通路与RA-ILD发病的关系。该研究通过建立RA-ILD动物模型,研究托法替布抑制JAK信号通路治疗RA-ILD的分子机制,为临床治疗RA-ILD提供新的方法。

1 材料与方法

1.1 材料博来霉素[批号:60216ES60,翌圣生物科技(上海)股份有限公司];醋酸泼尼松片(批号:20200902,华中药业股份有限公司);托法替布(批号:1H08112DC2,齐鲁制药有限公司);伊红染色液、苏木精染色液、PBS购自赛维尔生物科技有限公司;ELISA试剂盒:肿瘤坏死因子( tumor necrosis factor,TNF)-α、白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-10和IL-1β购自瑞新生物科技有限公司;JAK1、STAT1、GAPDH抗体、二抗购自爱博泰克生物科技有限公司。

1.2 动物24只雄性Wistar大鼠,40～50日龄,购于重庆恩斯维尔生物科技有限公司,在通风良好的房间内饲养,并在昼夜12 h/12 h的光照和黑暗循环中保持。所有实验方案按照《实验动物护理和使用指南》执行,动物实验经贵州中医药大学第二附属医院医学伦理委员会批准。

1.3 方法

1.3.1动物分组与建模 大鼠随机分为正常组、ILD模型组、醋酸泼尼松组、托法替布组,每组6只。除正常组外,其余3组大鼠麻醉仰卧位固定于手术台上,经气管插入18号大鼠导管后注入博莱霉素溶液3 mg/(ml·kg)造模。造模4周后,正常组、ILD模型组予1 ml/100 g生理盐水灌胃,醋酸泼尼松组(醋酸泼尼松用生理盐水溶解)以6 mg/kg的剂量、1 ml/100 g的体质量灌胃;托法替布组以1 mg/kg的剂量、1 ml/100 g的体质量灌胃,4组灌胃均为每日1次,连续灌胃28 d后处死动物取材做后续实验。

1.3.2HE染色 将肺组织用PBS清洗后用多聚甲醛固定,分别置于不同浓度乙醇中脱水后予二甲苯浸泡,放置于融化的石蜡中,用切片机将石蜡块中的组织切成2.5 μm厚的薄片,将切片放置于55 ℃烤片机上,使组织片紧贴于防脱玻片上,再次脱蜡、复水,苏木精染液染色,盐酸乙醇溶液进行分脱色,伊红染液染色,乙醇脱水、二甲苯透明、中性树脂封片,显微镜对切片进行图像采集。

1.3.3ELISA法检测血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10表达 按照试剂盒说明书:设置标准品孔和样本孔,加入不同浓度的标准品50 μl(样本孔先加待测样本10 μl和释品40 μl),每孔加入检测抗体100 μl,用封板膜封住孔板,37 ℃放置60 min弃去板孔中液体加满洗涤液,静置后弃去洗涤液,重复5次,每孔加入底物A、B各50 μl,37 ℃避光孵育15 min后,每孔加入终止液50 μl,在450 nm波长处测定各孔的吸光度(optical density,OD)值。

1.3.4Western blot法检测肺组织中JAK1、STAT1蛋白表达 将组织放在研钵中,加入适量液氮冷冻组织后研磨组织成粉末,加入RIPA裂解液充分裂解细胞并提取上清,制胶,放入电泳槽。分别从各样本总蛋白中取出500 μg与5×SDS上样缓冲液按4 ∶1比例混合,混合后蛋白的浓度为3.3 μg/μl,金属浴加热100 ℃ 6 min使蛋白变性后上样进行电泳,电泳完毕后取出膜并做好正反面标记,在TBST中清洗1 min,然后用5%脱脂牛奶封闭液室温封闭1 h后用TBST洗3次,用一抗稀释液按1 ∶1 000稀释一抗,4 ℃孵育过夜,用封闭液将二抗稀释成一定的浓度(1 ∶2 000),然后室温孵育1 h,TBST清洗3次,将曝光液均匀覆盖在整片膜上反应后放入曝光仪曝光检测。

1.4 统计学处理采用SPSS 25.0统计软件进行数据分析,图片使用GraphPad 9.4.1软件制作。计量资料符合正态分布及方差齐性采用单因素方差分析,非正态或方差不齐采用秩和检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况正常组自实验开始至结束精神状态可,皮毛光泽,反应灵活,饮食、饮水量、呼吸频率均正常,体质量自然增长;ILD模型组造模1 d后出现活动减少,毛色欠光泽、蜷缩,呼吸加快,耸毛、饮食和饮水减少,体质量减轻,实验后期体质量缓慢增长,饮食、饮水较少;醋酸泼尼松组造模后逐渐出现活动减少,毛色欠光泽,轻度耸毛、蜷缩、饮食减少,灌胃干预后体质量逐渐缓慢增长,呼吸频率逐渐缓慢至正常;托法替布组造模1 d后逐渐出现活动减少,毛色欠光泽,耸毛、蜷缩、饮食减少,灌胃干预后饮食逐渐恢复,体质量增长速度缓慢。

2.2 HE染色正常组肺泡结构清晰,肺泡壁结构完整正常。ILD模型组肺组织对比正常组趋向实化,大多数肺泡壁毛细血管充血,肺泡壁增宽增厚;血管及支气管周围淋巴细胞浸润,肺泡腔内有炎性渗出物;支气管管腔内有大量脱落的上皮细胞及炎症细胞;可见少量心衰细胞。与ILD模型组比较,醋酸泼尼松组肺泡壁增厚现象减轻,肺组织实化有所改善,但仍可见大量肺泡壁毛细血管充血、支气管管腔上皮细胞脱落及少量炎症细胞浸润。与ILD模型组比较,托法替布组肺泡壁增厚现象减轻,肺泡组织结构较为清晰,趋向正常组;少量肺泡壁毛细血管充血,支气管管腔内可见少量脱落的上皮细胞及炎症细胞,偶见炎性渗出物分布于肺泡腔内。见图1。

图1 各组大鼠肺组织病理切片A:正常组;B:ILD模型组;C:醋酸泼尼松组;D:托法替布组

2.3 Western blot法检测肺组织中JAK1和STAT1的蛋白表达ILD模型组中JAK1和STAT1的总蛋白水平高于正常组(P<0.01),经药物干预治疗后JAK1和STAT1的总蛋白水平低于ILD模型组(P<0.01);两组药物治疗比较:JAK1在醋酸泼尼松组与托法替布组比较差异无统计学意义(P>0.05),STAT1在醋酸泼尼松组与托法替布组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 各组肺组织中JAK1和STAT1的蛋白表达

2.4 ELISA测定大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β含量与正常组、醋酸泼尼松组、托法替布组比较,ILD模型组中TNF-α、IL-6、IL-1β浓度增高(P<0.01),IL-10浓度降低(P<0.01);与醋酸泼尼松组比较,托法替布组TNF-α、IL-6、IL-1β浓度增高(P<0.05),IL-10浓度降低(P<0.01)。以上结果表明托法替布可有效降低ILD血清水平TNF-α、IL-6、IL-1β及上调抑炎因子IL-10的表达发挥抗炎作用。见图3。

图3 血清中TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β表达

3 讨论

RA发病过程中的关键细胞因子包括干扰素(interferons,INF)-α/β、IL-1、IL-6、IL-10和TNF等[5]。正常情况下,这些被分泌至胞外的细胞因子或促进炎症或抑制炎症,相互调节,最终维持机体的免疫稳态。然而,在RA患者体内的促炎/抑炎因子稳态被打破,最终导致疾病的发展[6]。

JAK-STAT信号通路具有广泛的功能,是细胞外促炎因子通过膜受体向核内传导炎性信号的重要信号通路[7]。JAK是酪氨酸激酶的一种非跨膜形式,包括JAK1、JAK2、JAK3,STAT为信号转导和转录激活因子,在信号转导和基因转录中起着关键作用,JAK3主要通过与IL2Rγ链的细胞因子(IL-2、IL-4、IL-7、IL-9)结合从而活化T细胞,JAK1则主要与γ链的细胞因子结合,如IL-6、IL-10、IL-13及INFγ[8]。而T细胞及其分泌的TNF-α、IL-17等炎性因子在RA的发生发展过程中发挥重要的作用[9]。

在ILD患者体内存在大量的炎症因子,如IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10,而IL-1β、IL-6可以同时激活JAK1和JAK2通路,与受体耦联的JAK相互靠近并激活[10]。STAT1是成纤维细胞生长停滞的重要调节器,异常表达的JAK/STAT1信号通路在早期肺泡炎症及肺纤维化的形成过程中发挥重要作用[11],STAT1诱导炎症细胞在肺内聚集,引起血小板源性生长因子大量分泌,刺激平滑肌细胞、成纤维细胞增殖,从而导致肺纤维化形成。而TNF-α/β、IL-6、IL-10作为STAT1的重要始动因子,能激活STAT1并发生磷酸化,而TNF-α已被证明能增强炎症反应,促进纤维化,并推动肺炎性疾病的进展,IL-6作为促炎因子和促纤维化因子在肺纤维化中发挥作用,并在早期中和IL-6可改善肺纤维化[12]。相反,IL-10作为一种抗炎细胞因子,已经被证明对RA和ILD有保护作用[13]。Nakagome et al[14]报道小鼠静脉注射IL-10表达质粒可抑制博莱霉素诱导ILD小鼠TGF-β的产生,改善纤维化,从而诱导肺成纤维细胞的增殖,JAK/STAT信号通路的激活上调了TNF-α、IL-6等促炎性细胞因子的表达,导致炎症反应,说明JAK/STAT信号通路与肺纤维化密切相关[15]。

托法替布是作用于JAK-STAT信号通路的小分子JAK抑制剂(主要抑制JAK1和JAK3,轻度抑制JAK2),是近年来治疗RA的新型药物。本研究发现托法替布可通过抑制JAK/STAT使下游炎性细胞因子的合成减少起到治疗RA-ILD的作用。在本研究中,托法替布可有效改善ILD肺部组织病理及血清中炎症因子表达,有望在今后的RA-ILD临床治疗提供新的方案。但本研究药物干预仅为28 d,希望在今后的研究中能有更长的周期进一步观察托法替布对RA-ILD的有效性及安全性。此外,鉴于构建RA-ILD动物模型均为先构建RA动物模型后再予博来霉素构建ILD模型,并不能代表RA-ILD模型,因此,对RA-ILD动物模型的构建同样也是一个值得探索的方向。

综上所述,本研究表明,托法替布通过调控JAK/STAT信号通路,抑制下游炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α及上调抑炎因子IL-10的表达,显著减轻ILD肺部炎症。托法替布通过调控JAK/STAT信号通路治疗ILD是一种很有前途的新方法,值得临床进一步推广应用。