类风湿关节炎患者外周血TFH细胞TIGIT和PD1表达及意义

黄自坤,张 露,李 雪,罗 清

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种慢性炎症性自身免疫病,其主要特点是不可逆的骨关节炎症和破坏,其病因比较复杂,与遗传、环境和感染等多种因素有关[1]。虽然RA致病机制还不是很明确,但研究表明滤泡辅助性T细胞(follicular helper T, TFH)在RA致病性自身抗体的产生、病情缓解及进展中发挥重要作用[2],尤其是程序性死亡分子(programmed cell death 1, PD1)+TFH[3-4]。近年来,含T细胞免疫球蛋白和酪氨酸免疫抑制受体结构域蛋白(T-cell immunoglobulin and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif domain,TIGIT)在TFH上的表达受到极大的关注[5-6]。研究显示RA患者TFH细胞也可检测到TIGIT的表达[3],但TIGIT+TFH细胞在RA中的具体作用还不清楚。作为两种主要的负性共刺激分子,TIGIT和PD1在RA患者免疫细胞中共表达模式所呈现的作用还不清楚。而近期,有研究表明共表达PD1和TIGIT的CD8+T细胞与其功能调控[7]和抗PD1免疫治疗反应[8]有关。且有研究证实在外周血中存在一群共表达的TIGIT和PD1的TFH细胞[6]。然而,关于RA患者TFH细胞上TIGIT和PD1的共表达情况,以及相关的临床意义还鲜为报道。该研究通过检测RA患者和健康对照者外周血TFH细胞TIGIT和PD1的表达情况,系统性分析TIGIT+PD1-TFH、TIGIT+PD1+TFH、TIGIT-PD1+TFH细胞水平与疾病炎症程度、活动性以及自身抗体的关系,以期探讨不同共刺激分子表达的TFH在RA发病中的作用。

1 材料与方法

1.1 病例资料收集2017年10月—2019年9月于南昌大学第一附属医院风湿免疫科就诊的RA患者79例(RA组),其中女性55例,男性24例,年龄17～81(57.8±12.3)岁。所有患者RA都符合美国风湿病学会(ACR)制定的RA诊断标准[9],并排除其他严重疾病。选取对照者45例(HC组),为年龄和性别相匹配的健康体检者,其中女性27例,男性18例,年龄29～82(53.7±14.3)岁。详细收集RA患者临床资料及相关实验室检查结果,进行RA疾病活动性评分(disease activity score 28, DAS28)[10]。本实验经过医院伦理委员会批准[编号:(2022)CDYFYYLK(06-004)],参加者均知情同意。

1.2 仪器与试剂流式细胞抗体藻红蛋白标记的TIGIT抗体(phycoerythrin-TIGIT, PE-TIGIT)、异硫氰酸荧光素标记的PD1抗体(fluorescein isothiocyanate-PD1,FITC-PD1)、PC7标记的CXCR5抗体(PC7-CXCR5)购自美国eBioscience公司;藻红蛋白-得克萨斯红标记的CD4抗体(phycoerythrin-texas red,ECD-CD4)及相应的同型对照PE-IgGl和FITC-IgG1均购自美国Beckman Coulter公司。Cytomics FC 500流式细胞仪为美国Beckman Coulter公司产品,分析软件为仪器自带的CXP分析系统;外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)Ficoll-Paque分离液购自美国Sigma公司。

1.3 PBMC提取肘前静脉采集EDTA抗凝外周血5 ml,6 h内送检。采用PBMCFicoll-Paque分离液提取RA患者和对照者的PBMC。

1.4 流式细胞术检测单核细胞表面分子各取受试者100 μl 生理盐水重悬的PBMC加入2个试管中,按以下组合加入单克隆抗体各10 μl:ECD-CD4、PC7-CXCR5、PE-IgGl、FITC-IgGl; ECD-CD4、PC7-CXCR5、PE-TIGIT、FITC-PD1。4 ℃避光孵育30 min,如有红细胞,则用红细胞裂解液处理后,生理盐水洗涤,1 500 r/min离心5 min,弃上清液,重悬后用Cytomics FC 500流式细胞仪检测分析,使用CXP分析软件分析CXCR5+CD4+TFH细胞TIGIT和PD1的表达。

1.5 RA的其他实验室指标检测血沉(erythrocyte sedimentation rate,ESR)采用动态血沉仪法(北京普利生公司);类风湿因子(rheumatoid factor,RF)和C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)采用速率散色比浊法(美国Beckman Coulter公司);抗环瓜氨酸多肽抗体(anti-citrullinated protein antibodies, ACPA)采用酶联免疫吸附法(上海科新生物技术股份有限公司);血常规采用XN-10型仪器(日本Sysmex公司)进行检测。

2 结果

2.1 RA组和HC组外周血TFH细胞TIGIT和PD1表达水平的比较RA组TIGIT+TFH细胞百分率、TIGIT+TFH细胞TIGIT表达平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)与HC组比较差异无统计学意义。RA组PD1+TFH细胞百分率(U=1 196,P=0.002 5)、PD1+TFH细胞PD1表达MFI(U=1 134,P=0.000 8)高于HC组,差异有统计学意义。见图1。

图1 RA组与HC组外周血TFH细胞TIGIT和PD1表达水平

2.2 RA组与HC组外周血TIGIT+PD1-TFH、TIGIT+PD1+TFH和TIGIT-PD1+TFH细胞水平的比较TFH细胞可根据TIGIT和PD1的表达分为三群:TIGIT+PD1-TFH、TIGIT+PD1+TFH和TIGIT-PD1+TFH细胞。RA组TIGIT+PD1-TFH细胞百分率(U=1 112,P=0.000 5)低于HC组,TIGIT+PD1+TFH细胞百分率(U=1 319,P=0.017 3)和TIGIT-PD1+TFH细胞百分率(U=1 354,P=0.027 0)均高于HC组;RA组TIGIT+PD1-TFH细胞TIGIT表达MFI(t=0.594,P=0.553 6)、TIGIT+PD1+TFH细胞TIGIT表达MFI(t=0.146,P=0.884 0)与HC组差异无统计学意义,而RA组TIGIT+PD1+TFH细胞PD1表达MFI(U=920,P<0.000 1)、TIGIT-PD1+TFH细胞PD1表达MFI(U=1 177,P=0.001 8)均高于HC组。此外,RA组(U=744,P<0.000 1)和HC组(U=181,P<0.000 1)中TIGIT+PD1+TFH细胞TIGIT表达MFI均高于TIGIT+PD1-TFH细胞,RA组(t=3.99 0,P=0.000 1)和HC组(U=399,P=0.000 1)中TIGIT+PD1+TFH细胞PD1表达MFI均高于TIGIT-PD1+TFH细胞。见图2。

2.3 RA组外周血TIGIT+PD1-TFH、TIGIT+PD1+TFH、TIGIT-PD1+TFH细胞水平与自身抗体的关系RA患者血清中可以出现特异性的RF、ACPA等自身抗体,将其与TIGIT+PD1-TFH、TIGIT+PD1+TFH和TIGIT-PD1+TFH细胞水平进行相关性分析。结果显示,RA患者外周血TIGIT+PD1+TFH细胞PD1表达MFI与RF呈正相关(rs=0.317 6,P=0.007 4);TIGIT-PD1+TFH细胞百分率、TIGIT-PD1+TFH细胞PD1表达MFI、TIGIT+PD1+TFH细胞PD1表达MFI与阳性的RF(rs=0.311 0,P=0.019 7;rs=0.278 8,P=0.037 4;rs=0.461 5,P=0.000 3)呈正相关,TIGIT+PD1-TFH与RF不存在相关性。此外,本文也显示TIGIT+PD1-TFH、TIGIT+PD1+TFH和TIGIT-PD1+TFH细胞与ACPA抗体不存在相关性。

2.4 RA患者外周血TIGIT+PD1-TFH、TIGIT+PD1+TFH、TIGIT-PD1+TFH细胞与炎症指标的关系反映RA炎症程度的相关指标包括白细胞数量(white blood cell count,WBC)、淋巴细胞数量(lymphocyte count,Lym)、淋巴细胞比例(lymphocyte percentage,Lym%)、单核细胞数量、单核细胞比例、中性粒细胞数量(neutrophil count,Net)、中性粒细胞百分比(neutrophil percentage,Net%)、淋巴细胞与单核细胞比值、中性粒细胞与淋巴细胞比值(neutrophil- to-lymphocyte ratio,NLR)、血小板与淋巴细胞比值、系统性免疫炎症指数(systemic immune inflammation,SII)、衍生中性粒细胞与淋巴细胞比值(derived Neutrophil to lymphocyte ratio,dNLR)、ESR、CRP,将这些相关指标与外周血TIGIT+PD1-TFH、TIGIT+PD1+TFH、TIGIT-PD1+TFH细胞进行相关性分析。结果显示,RA患者外周血TIGIT+PD1-TFH细胞百分率与ESR(rs=-0.259 3,P=0.021 9)呈负相关,TIGIT-PD1+TFH细胞百分率与ESR(rs=0.239 6,P=0.034 6)呈正相关,TIGIT+PD1+TFH细胞百分率与Lym(rs=-0.265 9,P=0.018 5)呈负相关,但并未显示TIGIT+PD1-TFH、TIGIT+PD1+TFH、TIGIT-PD1+TFH细胞百分率与其他炎症指标存在明显相关性。进一步分析RA患者外周血TIGIT+PD1+TFH、TIGIT-PD1+TFH细胞PD1表达MFI与炎症指标关系,结果显示,TIGIT+PD1+TFH细胞PD1表达MFI与Lym%(rs=-0.291 8,P=0.009 1)呈负相关,与Net(rs=0.245 5,P=0.030 3)、Net%(rs=0.285 3,P=0.010 8)、NLR(rs=0.300 9,P=0.007 4)、SII(rs=0.295 9,P=0.008 5)、dNLR(rs=0.268 7,P=0.017 4)、ESR(rs=0.374 1,P=0.000 7)、CRP(rs=0.404 7,P=0.000 2)呈正相关,RA患者外周血TIGIT-PD1+TFH细胞PD1表达MFI与N(rs=0.226 9,P=0.045 8)、ESR(rs=0.295 6,P=0.008 6)、CRP(rs=0.368 3,P=0.000 9)呈正相关。

2.5 RA患者外周血TIGIT+PD1-TFH、TIGIT+PD1+TFH、TIGIT-PD1+TFH细胞与疾病活动性的关系分析RA患者外周血TIGIT+PD1-TFH、TIGIT+PD1+TFH、TIGIT-PD1+TFH与RA患者DAS28-ESR、DAS28-CRP、关节疼痛数(pain joint count,PJC)、关节肿胀数(swollen joint count,SJC)、视觉模拟评分(visual analogue scale,VAS)等疾病活动性指标的关系,结果显示:RA患者外周血TIGIT+PD1-TFH细胞百分率与DAS-ESR(rs=-0.284 5,P=0.020 6)呈负相关,并未发现与其他疾病活动性指标相关;RA患者外周血TIGIT+PD1+TFH细胞PD1表达MFI与DAS28-ESR(rs=0.455 0,P=0.000 1)、DAS28-CRP(rs=0.388 0,P=0.001 3)、PJC(rs=0.331 1,P=0.006 6)、SJC(rs=0.337 2,P=0.005 6)、VAS(rs=0.353 8,P=0.003 3)呈正相关;RA患者外周血TIGIT-PD1+TFH细胞PD1表达MFI与DAS28-ESR(rs=0.369 2,P=0.002 3)、DAS28-CRP(rs=0.365 7,P=0.002 5)、PJC(rs=0.354 6,P=0.003 5)、SJC(rs=0.299 6,P=0.014 5)、VAS(rs=0.266 1,P=0.029 5)呈正相关。

2.6 RA患者外周血TIGIT+PD1-TFH、TIGIT+PD1+TFH细胞水平与RA危险因素关系采用单因素和多因素(强迫引入法)分析TIGIT+PD1-TFH、TIGIT+PD1+TFH、TIGIT-PD1+TFH是否为RA的危险因素,结果显示降低的TIGIT+PD1-TFH细胞百分率和升高的TIGIT+PD1+TFH细胞百分率为RA发病危险因素。见表1。

3 讨论

TFH是近年来发现的一种特殊类型、具有促进B细胞成熟、转化为浆细胞以及诱导抗体产生能力的CD4+T细胞亚群。Piantoni et al[11]研究发现RA患者TFH细胞上表达高水平的诱导T细胞共刺激因子(ICOS)。有研究[12]表明CD28等共刺激分子也可表达于RA患者的TFH细胞中。此外,Cao et al[13]和Aldridge et al[4]发现RA患者TFH细胞PD1表达升高,升高的PD1+TFH细胞与RA患者的炎症水平和致病性抗体相关,且可作为预测疾病治疗后是否缓解的指标,这与本研究检测到的RA患者外周血中总PD1+TFH细胞水平明显高于对照者是相一致的。

近年来,TIGIT分子在对固有免疫细胞以及适应性免疫细胞的调节方面受到了重视。现有数据表明TIGIT可表达于TFH细胞中,并可调控TFH细胞功能,如Godefroy et al[6]发现TIGIT+TFH细胞在调控镰刀性贫血患者发生输血免疫反应中起着关键作用,虽然总的TIGIT+TFH细胞水平在疾病组与对照组间无差异;Akiyama et al[14]研究表明IgG4相关性疾病患者外周血的TIGIT+TFH细胞水平明显升高,且与IgG4相关性疾病的活动性及治疗疗效密切相关。近期的研究[3]结果显示RA患者PD1+TFH细胞上也可检测到TIGIT分子表达,提示TIGIT可能参与RA的发病过程,但其具体作用尚不明确。本研究采用流式细胞术检测79例RA患者和45例对照组外周血TFH细胞中TIGIT表达水平,结果显示两组总的TIGIT+TFH细胞百分率和TFH细胞的TIGIT表达MFI无差异,这些研究结果与其他人员关于TIGIT+TFH细胞水平在系统性红斑狼疮[15]、镰刀性贫血患者[6]与对照组中无差异的研究结果是相一致,但是不同于Akiyama et al[14]关于TIGIT+TFH细胞在IgG4相关性疾病患者中的分布。这些研究表明TIGIT+TFH细胞在不同免疫疾病中的含量及所执行的功能可能有所不同。

免疫细胞上TIGIT和PD1的共表达受到越来越多的关注[6-8],这些研究结果显示TIGIT和PD1在T细胞上的共表达与疾病临床结果和细胞功能调控有关。本研究结果表明TIGIT+PD1+TFH细胞、TIGIT-PD1+TFH细胞水平与疾病严重程度成正相关,患者疾病越严重,TIGIT+PD1+TFH细胞、TIGIT-PD1+TFH细胞水平越高。且TIGIT+PD1+TFH细胞、TIGIT-PD1+TFH细胞水平与自身抗体RF水平呈正相关。这些与近期对其他免疫相关性疾病的研究结果一致[14]。另外,TIGIT+PD1+TFH细胞与这些指标相关性的相关系数要高于TIGIT-PD1+TFH细胞,这与TIGIT和PD1双阳的TFH细胞其促进B细胞转化和抗体产生的能力明显高于共刺激分子单阳的TFH[6]是相符合的,提示TFH细胞上共表达的TIGIT和PD1具有协同作用。进一步逻辑回归分析也显示升高的TIGIT+PD1+TFH细胞是RA发病的危险因素,而升高的TIGIT-PD1+TFH细胞不是。这些结果表明TIGIT+PD1+TFH促进致病性自身抗体产生在RA发生发展中发挥重要作用。

研究表明TIGIT+PD1-TFH细胞是一群能促进B细胞活化和分化的功能性细胞[6]。本研究结果显示RA患者外周血TIGIT+PD1-TFH细胞水平降低,且TIGIT+PD1-TFH细胞水平越低,RA患者的疾病炎症程度和严重程度越高,患病越严重;而之前也有研究[16]证实RA患者外周血T细胞上负性共刺激分子TIGIT的表达水平降低,且与疾病活动性呈负相关。此外,本研究并未发现RA患者外周血中TIGIT+PD1-TFH细胞水平与自身抗体存在相关性,提示RA患者中TIGIT+PD1-TFH细胞可能是一群功能不同于之前研究[5]报道的细胞,RA患者中这群细胞并不是通过促进B细胞转化和抗体产生参与RA致病。进一步逻辑回归分析显示降低的TIGIT+PD1-TFH细胞水平是RA发病的危险因素,表明TIGIT+PD1-TFH在RA致病中呈现保护性作用。这些研究结果亦表明RA患者TIGIT+PD1-TFH细胞可能以不同于TIGIT+/-PD1+TFH细胞作用方式参与RA的发生发展,但其具体作用方式及机制还有待于进一步探索。

综上所述,RA患者外周血升高的TIGIT+PD1+TFH、TIGIT-PD1+TFH细胞水平与疾病的抗体产生、炎症程度及活动性有关;降低的TIGIT+PD1-TFH细胞水平与疾病的炎症程度及活动性有关。今后尚需进一步探讨TIGIT在TFH细胞及RA发生发展中作用及其机制,以期为RA治疗提供新靶点。