G-CSF通过MCTP1-AS1/SMAD7表观遗传调控途径抑制上皮间质化转变促进子宫内膜修复

贺泓霓,王江,胡辉权,袁心柱

人类子宫内膜在经历分娩、月经、感染等损伤后的快速重塑和再生对生殖至关重要[1]。子宫内膜修复障碍会导致月经异常、闭经、流产、不孕等一系列综合征[2]。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指上皮细胞经特定程序向具有间质表型细胞转化的过程[3],在多种疾病的发生发展和治疗中发挥重要作用[4]。若子宫内膜上皮细胞过度EMT,内膜表面会产生大量纤维沉积,使得子宫内膜功能层受损,最终导致宫腔粘连形成[5]。

粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)是一种糖蛋白,在人体多系统中起着重要作用[6-7],G-CSF可改善子宫内膜容受性和妊娠率[8]。到目前为止,G-CSF增加子宫内膜厚度、改善子宫微环境的具体机制和调控因素尚不明确。最近的一项研究发现,lncRNA MCTP1-AS1通过调控SMAD7轴调节子宫内膜细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT过程[9-10]。然而G-CSF能否通过调控MCTP1-AS1和SMAD7来介导子宫上皮细胞EMT尚缺少相关的报道。

本研究拟通过检测G-CSF在子宫上皮细胞中的表达,分别评估沉默G-CSF和过表达G-CSF对子宫上皮细胞EMT的影响,并探讨子宫上皮细胞EMT的过程是否涉及G-CSF-MCTP1-AS1/SMAD7通路,以寻找抑制子宫内膜上皮间质化、促进子宫内膜修复的新疗法和新治疗靶点。

1 材料和方法

1.1 细胞培养

人宫颈上皮细胞株:H8细胞,购自北京中原生物公司(ATCC中国一级代理商),将细胞于37℃、5% CO2条件下培养在含10%胎牛血清的杜尔贝科改良鹰培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium,DMEM)中。细胞传代:将细胞培养瓶放入培养箱中静置3 h,吸出DMEM,用磷酸盐缓冲溶液清洗细胞;添加1 mL 0.25%胰蛋白酶消化液以覆盖全部细胞,37℃水浴1～3 min。细胞回缩变圆后终止消化,接种培养瓶。然后置于细胞培养箱中培养。H8细胞培养72 h后终止培养。

1.2 实时定量聚合酶链反应

实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)是为了检测G-CSF、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin、Z0-1和SMAD7的相对RNA表达。使用 RNAiso Plus Kit,根据试剂盒说明书,从H8细胞中分离总 RNA。然后按照M-MLV 逆转录酶试剂盒 (Invitrogen,CA)的说明书,使用试剂盒中的试剂,将 RNA 逆转录为 cDNA。使用 ABI ViiaTM7 System (Thermo Fisher,USA),表1中的引物以及SYBR Green PCR Master Mix (Thermo Fisher,USA) 通过 qRT-PCR 扩增 cDNA 模板。将反应试剂的混合物在95℃下孵育5 min,并按照以下参数进行循环。95℃ 10 s,55℃ 15 s,72℃ 10 s,共40个循环,然后用LightCycler 480TL系统II在50℃中冷却10 s。

表1 本研究中使用的引物

1.3 质粒构建和细胞转染

通过克隆全长G-CSF cDNA的片段到pcDNA 3.1质粒(Invitrogen,USA)以产生pcDNA 3.1-PVT1,用于过表达G-CSF细胞系构建。空白pcDNA 3.1载体用作对照。使用LipofectamineTM2000(Invitrogen,USA)转导H8细胞。为敲低G-CSF,合成了小干扰RNA(si-PVT1)(Gene Pharma,中国上海)。将乱序小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)用作阴性对照 (si-NC)。按照LipofectamineTMRNA iMAX 转移试剂 (Invitrogen)说明,将 si-PVT1 转导 H8 细胞。分别将以上siRNAs或者过表达质粒转染H8细胞,分为对照组、G-CSF组、si-NC组和si-G-CSF组。转导 48 h后,收获 H8 细胞进行 qRT-PCR 以检验相关基因的表达效率。

1.4 G-CSF靶向结合MCTP1-AS1的验证

采用双荧光素酶报告基因实验来鉴定G-CSF和MCTP1-AS1的靶标关系。取对数增殖期的H8细胞 ,接种于6孔细胞板中 ,应用 Lipo-fectamine 2000转染试剂,分别将野生型(wild-type,WT)G-CSF荧光素酶报告基因质粒G-CSF-WT、突变型(mutant,MUT)G-CSF荧光素酶报告基因质粒G-CSF-MUT与MCTP1-AS1 mimics或RNA-NC共转染至H8细胞,分别为MCTP1-AS1 mimics+G-CSF-WT组、miRNA-NC+G-CSF-WT组、MCTP1-AS1 mimics+G-CSF-MUT组、miRNA-NC+G-CSF-MUT组。转染24 h后,收集细胞,应用荧光素酶检测试剂盒检测细胞的相对荧光素酶活性。荧光素酶报告基因质粒由广州复能基因有限公司提供。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 过表达和沉默G-CSF的H8细胞模型构建

为确定G-CSF参与纤维化的调节,分别将pcDNA3.1-G-CSF和si-G-CSF转染细胞以过表达和沉默G-CSF。qRT-PCR测定结果显示,pcDNA 3.1-G-CSF转染之后G-CSF的表达上调,当si-G-CSF转染之后,G-CSF表达被下调 。详见图1。以上结果证明 pcDNA 3.1-G-CSF和 si-G-CSF在 HESC 细胞中分别具有高的过表达效率和敲低效率。

图1 过表达和敲低G-CSF细胞系的目标基因表达

2.2 G-CSF表达对H8细胞EMT的抑制作用

为进一步证明G-CSF在细胞EMT中的作用,使用qRT-PCR实验检测E-cadherin、Z0-1、N-cadherin、Vimentin等EMT标志物。通过转染G-CSF过表达质粒使G-CSF过表达及转染si-G-CSF使G-CSF沉默后,观察到G-CSF过表达显著地抑制N-cadherin和Vimentin的表达,促进E-cadherin和Z0-1的表达;而在沉默G-CSF后显著促进了N-cadherin和Vimentin的表达,抑制E-cadherin和Z0-1的表达。详见图2。这些数据证明G-CSF过表达抑制了H8细胞的EMT过程,而G-CSF敲低后促进了H8细胞的EMT过程。

图2 G-CSF过表达及沉默后E-cadherin等的相对表达量

2.3 G-CSF靶向MCTP1-AS1

双荧光素酶报告基因实验结果显示,MCTP1-AS1 mimics+G-CSF-WT组、miRNA-NC+G-CSF-WT组、MCTP1-AS1 mimics+G-CSF-MUT组、miRNA-NC+G-CSF-MUT组H8细胞的相对荧光素酶活性分别为0.41±0.14、1.08±0.12、0.98±0.08、1.04±0.12。与miRNA-NC+G-CSF-WT组相比,MCTP1-AS1mimics+G-CSF-WT组H8细胞的相对荧光素酶活性降低(t=7.14,P<0.05);而与miRNA-NC+G-CSF-MUT组相比,MCTP1-AS1 mimics+G-CSF-MUT组H8细胞的相对荧光素酶活性无明显变化(t=1.56,P>0.05)。说明G-CSF在H8细胞中能够靶向MCTP1-AS1。详见图3。

图3 各组H8细胞的相对荧光素酶活性

2.4 G-CSF通过MCTP1-AS1/SMAD7表观遗传调控途径抑制EMT

研究发现,过表达的G-CSF可以抑制MCTP1-AS1和SMAD7的表达;相反,当G-CSF被敲除时,MCTP1-AS1和SMAD7的表达水平上调。详见图4。以上结果提示G-CSF可能直接参与MCTP1-AS1/SMAD7信号的调控。

图4 G-CSF过表达或敲低后MCTP1-AS1、SMAD7 mRNA的相对表达

3 讨论

G-CSF是集落刺激因子家族的重要分子,可对中性粒细胞系的释放、分化和增殖产生促进作用[11-12]。在生殖领域,G-CSF对卵泡的发育、子宫内膜脱落与增殖等过程密切相关[13]。2011年,Gleicher等[9]学者报道,G-CSF可调节子宫内膜细胞微环境,促进子宫内膜生长。G-CSF宫腔灌注可增加子宫内膜厚度,改善体外受精-胚胎移植患者临床结局[11-12]。然而到目前为止,G-CSF增加子宫内膜厚度、改善子宫微环境的具体机制和调控因素尚不明确。本研究利用qRT-PCR技术揭示了G-CSF在H8细胞中的差异化表达模式,发现G-CSF过表达可能会抑制N-cadherin和Vimentin的表达,促进E-cadherin和Z0-1的表达;而沉默G-CSF可能促进了N-cadherin和Vimentin的表达,抑制了E-cadherin和Z0-1的表达。这些数据能够证明,G-CSF可能参与H8细胞的EMT过程。

近期有研究发现,MCTP1-AS1在子宫内膜癌组织中与其配对的正常相邻组织相比表达下调,这表明MCTP1-ASP1也可能是子宫内膜癌的癌基因[14]。然而,很少有研究报道MCTP1-AS1在子宫内膜EMT中的作用。SMAD家族在介导转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信号通路中起着重要作用,该通路包括三个功能类别:常见SMAD、受体调节SMAD和抑制性SMAD。Parikh等[15]研究表明,在卵巢癌中,SMAD7通过影响SMAD2/3的表达和激活来调节TGF-β信号通路。Kharma等[16]研究发现,STAT1通过调节SMAD7来促进浆液性乳头状子宫内膜癌的肿瘤进展。然而,在皮肤黑色素瘤中,SMAD7的高表达与肿瘤侵袭性的几个特征正相关[17]。此外,几项研究表明SMAD7在许多炎症相关疾病中起着重要作用。例如,Xu等[18]揭示SMAD7可能在骨关节炎的发展中发挥抑制作用,表明MCTP1-AS1可能经SMAD7调节相关表型。这为子宫内膜相关疾病的发病机制和临床研究提供了新的思路。在本研究中,双荧光素酶报告基因实验结果说明G-CSF与MCTP1-AS1存在调控关系。在进一步研究中发现,G-CSF可以进一步抑制MCTP1-AS1和SMAD7的表达,提示G-CSF可能直接参与MCTP1-AS1/SMAD7信号的调控。

EMT是子宫内膜细胞正常增殖与脱离的重要前提,这一过程中上皮细胞极性丧失,形成了一种以细胞骨架重塑和迁移活动为特征的间充质样特性。本研究发现,H8细胞中G-CSF可抑制间质标志物N-cadherin和Vimentin表达,促进上皮标志物E-cadherin和Z0-1的表达,抑制EMT进程,这与Ding等[19]学者报道G-CSF在子宫内膜癌中的抗EMT作用一致。

综上,本研究发现G-CSF可通过MCTP1-AS1/SMAD7表观遗传调控途径抑制上皮间质化转变而促进子宫内膜修复,同时研究表明G-CSF可能是用于治疗薄型子宫的一个新靶点。