阿魏酸在烟曲霉菌诱导人角膜上皮细胞中的抗炎作用

张飒飒,鲁叶慧,熊翌宏,杨珊珊,吴媛,彭旭东

(1 青岛大学附属医院眼科,山东 青岛 266003; 2 湖北医药学院药护学院)

烟曲霉菌是一种常见的真菌性角膜炎的致病真菌[1],可黏附于角膜上皮从而免于宿主的免疫清除[1-2]。真菌感染时,各种免疫细胞在真菌清除方面发挥重要防御作用[3-4];但是其引发的过度炎症反应会加重组织损伤[5-6]。目前临床除了常用药物外[7],还需要寻找安全高效的抗炎药物实现抗真菌联合免疫治疗。阿魏酸(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸, FA)是一种酚类化合物,可溶于二甲基亚砜(DMSO),它具有抗炎[8-9]、抗氧化[10]、肝脏保护[11]等功效。LAMPIASI等[12]研究发现,FA在脂多糖(LPS)刺激的小鼠RAW264.7细胞中发挥抗炎作用。最近CAO等[8]研究发现,FA可降低促炎因子表达,改善肝损伤的预后,在乙醇性肝损伤中起保护作用[13]。本研究旨在探讨FA在烟曲霉菌诱导的炎症中的抗炎作用,为真菌性角膜炎的治疗提供新思路。现将结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 实验材料

人角膜上皮细胞(HCEC)由厦门眼科实验室馈赠,将其接种到10 cm细胞培养皿中,在含有体积分数0.10 胎牛血清的DMEM培养基中培养(37 ℃,含体积分数0.05 CO2培养箱)。烟曲霉菌(CPCC 3.0772)购自中国微生物菌种保藏中心(SGMCC);FA(100 mg,纯度98%)由麦克林试剂公司提供,用体积分数0.001的DMSO溶解后以100 mmol/L储备液存放于-80 ℃;RNAex pro reagent裂解液由艾科瑞生物公司提供;酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒由Biolegend公司提供;HiScript Ⅲ RT SuperMix(南京诺唯赞生物公司)。

1.2 实验方法

1.2.1烟曲霉菌丝制备 将烟曲霉菌接种到沙氏液体培养基中培养48～72 h(37 ℃,含体积分数0.05 CO2培养箱),待培养基中覆盖白色绒毛团块状菌落,将菌落转移至玻璃研磨棒中研磨至匀浆状态,加入体积分数0.75乙醇灭活(4 ℃,48 h)后得到灭活烟曲霉菌丝,使用血细胞计数器计数并调整菌丝浓度至1×1011CFU/L后用于体外细胞实验。

1.2.2FA溶液制备 用无菌PBS将FA溶液稀释至实验需要浓度(0～300 μmol/L)用于后续实验,FA溶液中DMSO含量低于1‰。

1.2.3CCK-8细胞毒性实验检测HCEC存活率96孔板中加入HCEC,达到80%融合时,向细胞中加入新的DMEM细胞培养液或含不同浓度FA(0～300 μmol/L)的DMEM细胞培养液,继续孵育24 h(37 ℃,含体积分数0.05 CO2培养箱),弃去培养液并加入PBS洗去悬浮细胞及药物残留。向96孔板中分别加入100 μL的DMEM细胞培养液和10 μL CCK-8检测试剂,37 ℃孵育2 h。使用酶标仪检测各孔450、600 nm波长处吸光度并计算细胞存活率。

1.2.4实时聚合酶链反应(RT-PCR)检测HCEC中炎症因子及核因子E2相关因子2(Nrf2)mRNA表达 将细胞加入12孔板或96孔板,随机分为空白对照组(A组)、单纯FA处理组(B组)、单纯加菌处理组(C组)和加菌+FA处理组(D组),向HCEC加或不加FA(终浓度250 μmol/L)预处理2 h,并向每孔中加入灭活烟曲霉菌菌丝(1×1011CFU/L)60 μL培养24 h(37 ℃,含体积分数0.05 CO2培养箱)。吸弃培养液并加入PBS洗涤3次,各孔中加入500 μL RNAex pro reagent裂解液,充分研磨并转移入EP管中提取总RNA。采用RNA紫外线可见光度法(Nanodrop 2000,Thermo Fisher)测定总RNA浓度,应用HiScript Ⅲ RT SuperMix处理RNA样本并逆转录为cDNA。根据产品说明书方法向cDNA样本中加入DEPC水和SYBR预混液,进行RT-PCR分析(QuantStudioTM5 实时荧光定量 PCR 系统,Thermo Fisher)。RT-PCR的引物及其序列见表1。

表1 RT-PCR基因引物及其序列

1.2.5ELISA法检测HCEC炎症因子IL-6及单核细胞趋化蛋白(MCP-1)蛋白表达水平 根据1.2.4方法将HCEC分组并处理,4 ℃、5 000 r/min离心后取上清液并转入新的EP管中,应用ELISA试剂盒采用双抗体夹心法检测各组IL-6和MCP-1蛋白表达水平,按试剂盒说明进行操作。酶标仪检测450 nm及570 nm波长处吸光度,以其表示IL-6和MCP-1蛋白表达水平。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 不同浓度FA溶液对HCEC活力的影响

不同浓度的FA(0、50、100、150、200、250及300 μmol/L)与HCEC共孵育24 h后,300 μmol/L FA溶液处理组HCEC存活率低于其他各组,差异均有统计学意义(n=6,F=5.390,P<0.05)。250 μmol/L及以下浓度FA溶液处理组的HCEC存活率与正常对照组(N组)相比差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。后续实验选择250 μmol/L作为研究浓度。

图1 不同浓度FA处理组HCEC存活率比较

2.2 FA对烟曲霉菌诱导的HCEC炎症因子以及Nrf2 mRNA表达的影响

RT-PCR法检测结果显示,FA处理(FFA=7.195～18.560,P<0.01)、灭活菌丝处理(FAF=23.130～141.468,P<0.001)、FA与灭活菌丝处理产生的交互效应(FFA×AF=8.731～18.536,P<0.01)对HCEC炎症因子IL-1β、IL-6及TNF-αmRNA表达的影响均有统计学意义。单独效应结果显示,不用灭活菌丝处理时,FA处理和不处理对mRNA的表达均无影响(P>0.05);用灭活菌丝处理时,FA处理组的IL-1β、IL-6及TNF-αmRNA表达较不处理组明显降低(F=15.889～47.471,P<0.001)。不用FA处理时,灭活菌丝处理和不处理对IL-1β、IL-6及TNF-αmRNA表达的影响均有统计学意义(F=30.141～94.603,P<0.001);用FA处理时,灭活菌丝处理和不处理相比,各因子mRNA表达水平差异均有统计学意义(F=4.720～23.860,P<0.05)。双因素析因方差分析还显示,FA处理(FFA=4.860,P<0.05)及灭活菌丝处理(FAF=37.652,P<0.05)对Nrf2mRNA表达影响有统计学意义;但FA与灭活菌丝处理无交互效应(FFA×AF=2.757,P>0.05)。见表2。

表2 FA对IL-1β、IL-6、TNF-α和Nrf2 mRNA表达的影响

2.3 FA对烟曲霉菌诱导的HCEC中IL-6以及MCP-1蛋白表达的影响

ELISA方法检测结果显示,FA处理(FFA=299.155、388.573,P<0.01)、灭活菌丝处理(FAF=421.591、809.406,P<0.01)、FA与灭活菌丝处理产生的交互效应(FFA×AF=258.206、298.778,P<0.01)对IL-6及MCP-1蛋白表达的影响均有统计学意义。单独效应结果显示,不用灭活菌丝处理时,FA处理和不处理对IL-6及MCP-1蛋白的表达均无影响(P>0.05);用灭活菌丝处理时,FA处理较不处理IL-6及MCP-1蛋白表达均明显降低(F=556.608、684.406,P<0.01)。不用FA处理时,灭活菌丝处理和不处理对IL-6及MCP-1蛋白表达的影响差异均有显著性(F=715.097、990.964,P<0.01);用FA处理时,灭活菌丝处理和不处理相比,IL-6及MCP-1蛋白表达水平差异均有统计学意义(F=5.273、76.648,P<0.05)。见表3。

表3 FA对IL-6及MCP-1蛋白表达的影响

3 讨 论

真菌性角膜炎是导致病人眼部溃疡、穿孔甚至失明的一种严重的眼部感染性疾病[14]。在亚洲发展中国家的真菌感染中,丝状真菌感染占据主导地位[15]。植物性角膜损伤、角膜接触镜的使用及局部类固醇的使用已被公认为真菌性角膜炎的主要危险因素[15]。真菌侵入宿主角膜组织后,真菌细胞壁上的病原体相关分子模式受体通过释放毒素攻击受损的角膜组织,并被宿主先天免疫细胞表达的模式识别受体识别[16]。这一相互作用诱导细胞因子和趋化因子的产生及释放[17],并招募中性粒细胞及巨噬细胞向感染灶聚集[18],真菌释放的细胞毒性物质及免疫细胞聚集引发的过度炎症反应使得真菌性角膜炎溃疡愈合缓慢、预后不良。真菌性角膜炎的发病率逐年增高,亟待找到新的治疗药物。

FA为从当归、川芎、赤芍等中草药中提取的一种酚酸类化合物,相关研究发现它具有抗氧化[19]、抗炎[20]、抗凋亡[9]、抗菌[21]、心肌保护[22]及神经保护[23]等药理作用。ERMIS等[24]研究发现,在吲哚美辛诱导的大鼠胃溃疡模型中,FA通过抑制中性粒细胞浸润及降低炎症因子IL-6及TNFα的表达,减轻胃黏膜充血、出血及溃疡的严重程度,从而改善大鼠胃溃疡的预后。而FA在真菌性角膜炎中的作用尚未见报道。本文研究结果显示,250 μmol/L FA对HCEC的活性没有影响,因此250 μmol/L FA可作为安全浓度用于后续实验。

真菌性角膜炎早期通过招募固有免疫细胞产生炎症反应,发挥对真菌的清除作用,但持续的炎症反应会加重组织的损伤[25]。中性粒细胞等免疫细胞的持续激活和招募会进一步导致更多的炎症因子及趋化因子的产生和释放[26],这不利于真菌性角膜炎的预后。本文RT-PCR检测结果表明,加菌刺激组炎症因子IL-1β、IL-6及TNF-αmRNA表达显著,即在真菌感染早期炎症因子如IL-1β、IL-6及TNF-α等表达增加,从而诱导炎症细胞的浸润及释放多种炎症递质进一步放大炎症反应来抵御真菌;而加菌处理后给予FA治疗可以显著抑制HCEC中IL-1β、IL-6及TNF-αmRNA的表达,从而减轻相关炎症反应。LI等[27]研究发现,在LPS诱导的人HMC3小胶质细胞的神经炎症模型中,FA通过抑制IL-1β、TNF-α及一氧化氮的产生及表达发挥抗神经炎症作用。本文研究结果与其相一致。为了进一步确认FA在烟曲霉菌刺激的HCEC中的抗炎作用,本研究应用ELISA方法检测IL-6及MCP-1蛋白表达,结果显示,250 μmol/L的FA能够显著抑制烟曲霉菌刺激的HCEC炎症反应中IL-6及MCP-1蛋白表达上调。有研究显示,在乙醇诱导的C57BL/6小鼠肝损伤模型中,FA可以显著降低丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶的血清酶活性,减少乙醇刺激后小鼠肝脏细胞细胞质的空泡性坏死及炎症细胞的浸润,抑制MCP-1和IL-6的表达,减轻乙醇对小鼠肝脏的损害[13]。本文研究结果与其相一致。提示FA可以通过下调真菌性角膜炎炎症因子及趋化因子的过度表达来改善真菌性角膜炎的炎症反应。

在真菌性角膜炎病程中,在控制真菌感染后期炎症反应的同时可以着力促进角膜上皮的修复,从而改善真菌性角膜炎的预后。已有研究显示,Nrf2不仅可以抑制促炎因子及炎症标志物的过表达,还可以通过与血红素氧合酶(HO-1)启动子抗氧化反应元件结合上调HO-1的表达,从而进一步抑制促炎因子的过表达,提示Nrf2/HO-1信号通路在炎症反应中发挥负调控作用[28-29]。我们实验室早先的研究发现,萜类化合物紫苏醛、衣康酸二甲酯及没食子酸可通过增加Nrf2和HO-1的表达,抑制IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α等炎症因子的表达,在真菌性角膜炎中发挥强大的抑炎作用[26,30]。而FAN等[26]的研究结果显示,紫苏醛通过Nrf2/HO-1信号通路下调IL-1β、IL-6及TNF-α的表达水平从而发挥强大的抗炎作用。其研究还发现,在烟曲霉菌感染的早期Nrf2表达水平上调,参与烟曲霉菌感染的免疫应答,且Nrf2/HO-1信号通路可通过抑制下游炎症因子的表达水平发挥抗炎作用。本文研究结果显示,单纯加菌处理组Nrf2mRNA的表达增加,而加菌加FA处理组Nrf2mRNA表达相较于单纯加菌处理组显著上调。由此我们认为,在烟曲霉菌刺激的HCEC中,FA通过增加Nrf2的表达水平发挥抗炎作用。

综上所述,FA能够通过增强Nrf2的表达和调控炎症因子及趋化因子的表达,减轻烟曲霉菌感染后HCEC的炎症反应。以后的研究可能倾向于探讨FA在体内外烟曲霉菌感染模型中发挥抗炎作用的多种机制,以期推进FA用于真菌性角膜炎治疗的临床研究。