原发性胆汁性胆管炎病人咽漱液中EB病毒分型

吴海梅,赵真真,周永,薛枫,辛永宁,宣世英

(1 南京医科大学附属青岛市市立医院感染科,山东 青岛 266071; 2 南京医科大学附属青岛市市立医院临床研究中心;3 青岛市第六人民医院感染科)

EB病毒(EBV)是疱疹病毒科嗜淋巴细胞属成员,感染了世界上95%以上的人口,且与多种自身免疫性疾病有关[1-3]。原发性胆汁性胆管炎(PBC)的发病机制尚不清楚,但该病本质上是自身免疫性疾病[4]。有研究发现,PBC与EBV感染之间存在关联[5-7]。EBV相关疾病的分布具有明显的地域差异,提示不同地区的EBV流行株可能有序列及生物学功能上的差异。EBV最常见的分型方式为基于EBV核抗原(EBNA)2、3A、3B及3C的抗原性及基因序列而区分的1/2分型。多数研究认为,1/2分型具有地域相关性,也有研究显示EBV-2型感染可能与鼻咽癌(NPC)发生有关[8]。而基于EBNA1的基因序列,亦可以将其划分为5种亚型:P-ala、P-thr、V-val、V-leu和V-pro。该分型方式同样具有疾病特异性[9]。本研究首次对PBC病人咽漱液中EBV进行1/2分型检测及EBNA1的多态性分析,旨在确定EBV的基因亚型与PBC疾病相关性。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 标本采集及DNA提取

收集青岛市市立医院及青岛市第六人民医院收治的54例PBC病人的咽漱液标本,病人籍贯均为山东省并且长期居住在青岛市。PBC诊断参照《原发性胆汁性胆管炎的诊断和治疗共识(2021)》的标准[10]。排除标准:①合并自身免疫性肝炎、原发性硬化性胆管炎、IgG4相关性肝胆疾病等其他自身免疫性肝病的病人;②合并甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等嗜肝性病毒感染,或人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒等非嗜肝性病毒感染的病人。健康人群咽漱液标本均来自在山东省居住的健康成年人群。取30 mL无菌生理盐水漱口1 min后采样,标本采集后采用江苏康为世纪公司的通用式组织DNA抽提试剂盒抽提细胞DNA。

1.2 EBV 1/2分型检测

参考SAMPLE等[11]的报道设计PCR引物,扩增EBNA3C序列(表1)。取5 μL PCR扩增产物于含溴化乙锭的20 g/L琼脂糖凝胶中电泳,凝胶成像系统记录电泳结果。每次PCR反应均用无酶双蒸水作阴性对照。PCR反应体系及反应条件参考ZHAO等[12]的文献。

表1 EBV 1/2分型及EBNA1基因序列多态性检测所用引物序列

1.3 EBNA1基因序列多态性检测

1.3.1PCR扩增 依据B95-8原型株序列,参考ZHAO等[12]的报道设计扩增EBNA1基因的引物,引物序列及PCR产物长度见表1。采用巢式PCR扩增EBNA1C-末端AA404-641(nt109159-109875)之间的序列,EBNA1-1、EBNA1-2为第1轮扩增引物,EBNA1-3、EBNA1-4为第2轮扩增引物。取第1次PCR扩增产物5 μL作为第2次PCR的模板,PCR反应体系及条件参考相关文献[12]。每次PCR反应均设水对照。取5 μL PCR产物置于15 g/L琼脂糖凝胶中电泳。

1.3.2测序分析 取上述PCR产物25 μL送北京华大基因有限公司进行测序,采用Snapgene软件查看所获序列峰图文件,利用DNAStar软件(Larsergene,version 7.0)进行序列剪接和对比分析,并在美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中与B95-8原型株(GenBank登录号V01555)序列进行对比分型。采用BHATIA等[13]和GUTIÉRREZ等[14]的分类方法,以AA487为特征性AA,结合其他共有突变对序列将EBNA1基因分为P-ala、P-thr、V-val、V-leu和V-pro 5种亚型,将具有相同共有突变的序列归为1种变异类型。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 EBV感染率与1/2分型

本文54例病人标本中均检出EBV感染,感染率为100%,其中1型EBV感染31例(57.4%),2型EBV感染19例(35.2%),1+2型EBV混合感染4例(7.4%)。图1为部分标本EBNA3C片段PCR产物电泳结果。健康人群EBV 1/2分型结果:1型EBV感染45例(45/57,78.9%),2型EBV感染10例(10/57,17.6%),1+2型混合感染2例(2/57,3.5%)[15]。将1+2型EBV感染病人与2型EBV感染病人合并进行统计分析,结果显示,PBC病人2型EBV感染率(23/54,42.6%)明显高于健康人群(12/57,21.1%),差异具有统计学意义(χ2=5.959,P=0.015,OR=2.782,95%CI=1.208～6.410)。

注:EBNA3C片段PCR产物153 bp者为EBV-1型,246 bp者为EBV-2型,同时出现153 bp和246 bp者为1+2型EBV混合感染。1～10为PBC样本,其中1、2、7、9为EBV-1型,3、4、6、8为EBV-2型,5、10为1+2型EBV混合感染;11～13为对照,其中11为无酶双蒸水对照,12为EBV-1型(B95-8细胞)对照,13为EBV-2型(P3HR1细胞)对照。

2.2 EBV 1/2分型与PBC病人临床特征关系

EBV-2型病人直接胆红素(DBil)异常升高比例显著高于EBV-1型(χ2=9.714,P=0.002);EBV-1型PBC病人与EBV-2型PBC病人之间性别、年龄、体质量指数(BMI)以及总胆红素(TBil)、间接胆红素(IBil)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰转移酶(GGT)、总胆汁酸(TBA)等肝功能指标比较,差异均无显著性(P>0.05)。见表2。

表2 EBV 1/2分型与PBC病人临床特征的关系(例)

2.3 EBNA1基因序列多态性

2.3.1EBNA1C端序列变异类型 本研究成功扩增52例PBC病人的EBNA1片段,共检出4种变异类型:P-ala、P-thr、V-val和V-leu。有5份PBC病人标本在用Snapgene软件查看峰图序列时发现AA487等共有突变位点出现超过1种亚型的特征性突变,经反复测试最后鉴定为混合感染。其中有2份标本为P-thr+V-leu混合感染,1份标本为V-val+P-thr混合感染,1份标本为V-val+V-leu混合感染,1份标本为P-thr+P-ala混合感染。

2.3.2EBNA1亚型在PBC病人和健康人群中的分布 在PBC病人标本中最多见的变异类型为P-thr变异型(27/52,51.9%),其次为V-val变异型(18/52,34.7%)。在健康人群中最多见的变异类型为V-val变异型(34/55,61.8%)[15]。P-thr携带者(31/52,59.6%)在PBC病人中所占比例明显高于健康人群(18/55,32.7%)(χ2=8.290,P=0.004,OR=3.253,95%CI=1.440～7.347)。见表3。

表3 EBNA1亚型在PBC病人和健康人群中的分布(例(χ/%))

2.3.3EBNA1亚型与1/2分型的关系 EBV-1型病人主要的EBNA1亚型为V-val和P-thr,共占96.2%(26/27),EBV-2型病人主要的EBNA1亚型为P-thr,占64.7%(11/17)。EBV-1型与EBV-2型PBC病人之间EBNA1亚型的分布差异无显著性(χ2=3.858,P=0.277)。见表4。

表4 EBNA1亚型与1/2分型的关系(例(χ/%))

2.3.4EBNA1基因序列多态性与PBC病人临床特征关系 P-thr、V-val 2种EBNA1亚型病人之间性别、年龄、BMI及肝功能指标比较,差异均无显著性(P>0.05)。见表5。

表5 P-thr、V-val亚型与PBC病人临床特征的关系(例)

3 讨 论

PBC是一种慢性的自身免疫性疾病,其病因是免疫介导的小胆管进行性破坏,其典型特征是血清中存在抗线粒体抗体。PBC病人的肝脏和唾液样本中均存在EBV-DNA水平升高[5-6]。MORSHED等[6]研究结果显示,有61%的PBC病人外周血单个核细胞中EBV-DNA水平增加,而在健康对照组中仅有11%。BARZILAI等[7]研究结果表明,PBC病人EBV早期抗原IgG滴度升高。以上研究均提示PBC的发生发展可能与EBV感染有关。

本研究共纳入54例PBC病人,其EBV感染率为100%。全世界95%以上的健康成人携带EBV,最新的研究显示,美国、巴西、墨西哥成年男性EBV平均感染率为97.3%[16]。本研究所有PBC病人均感染EBV,这可能与本研究纳入人群年龄较大,感染风险随着年龄增长亦增高有关。

1型EBV是世界范围内的优势流行株,而2型EBV主要在非洲地区感染率较高[17]。本研究PBC病人咽漱液标本中2型EBV的检出率明显高于健康人群,提示2型EBV感染可能与PBC有关。在体外1型EBV比2型EBV更加容易转化初始B淋巴细胞,而2型EBV由于细胞活化T细胞核因子(NFAT)c1/c2转录因子活性的增加以及EBV即刻早期蛋白(BZLF1)启动子Zp-V3的普遍存在导致受感染B细胞有更高的裂解能力[18-19]。有人推测2型EBV可能在免疫系统紊乱病人中更常见[17]。这提示EBV-2型与免疫功能有关,也部分解释了PBC病人中EBV-2型感染比例更高的原因。

V-val型是北方地区最多见的EBNA1变异类型。而本研究PBC病人中所占比例最高的则是P-thr型,且PBC病人P-thr型所占比例显著高于健康人群。有研究结果表明,V-val变异型EBNA1比B95-8原始株有更高的转录活性以及维持宿主细胞存活的能力,且来自不同地域的EBV相关胃癌(EBVaGC,日本和美国)及NPC(中国北方)的结果均显示V-val为EBNA1主要亚型[9]。提示PBC病人的P-thr分型比例增高具有疾病特异性,P-thr亚型可能与PBC具有相关性。EBV表位的分子拟态导致对自身抗原的耐受性丧失以及表位传播可能是EBV导致自身免疫疾病发生与发展的机制之一[20]。在动物实验中,用EBNA1DNA免疫不仅可以产生抗EBNA1抗体,还可以产生自身抗体并导致狼疮样自身免疫性疾病[21]。EBNA1蛋白功能区域如DNA结合-二聚化部位(AA452-607)、转录激活部位(AA325-376、AA65-89)、USP7结合部位(AA442-459)等均位于C-末端[22],因此EBNA1 C端的突变可能对其功能产生影响。例如有研究发现,EBNA1DNA结合域的氨基酸改变导致NPC细胞中DNA的复制能力受损,EBNA1的AA325-376缺失可以影响其转录激活的功能[23]。故推测EBNA1序列多态性可能通过改变病毒DNA复制、转录等功能参与疾病发生发展[24]。EBNA1在诱导自身免疫反应等方面具有重要作用,而P-thr亚型中大多数突变位点位于功能区域,今后需对该亚型继续深入研究,进一步阐明其在PBC发生发展过程中的作用与机制。

EBV-2型PBC病人DBil异常升高比例显著高于EBV-1型病人,而EBV-1型与EBV-2型PBC病人之间性别、年龄、BMI和除外DBil的肝功能指标差异均无显著性。机体胆红素浓度升高可以抑制细胞核因子κB(NF-κB)信号通路激活,从而诱导炎症因子的表达和加重炎症反应,并可以引起脂质过氧化损伤[25]。DBil为PBC病人临床治疗中常用的反映肝功能的指标,其异常升高与病人临床症状及预后有关[10,26]。因此我们认为,EBV-2型感染与PBC病人的肝损伤有关,其具体机制还有待进一步研究。

综上,2型EBV感染及P-thr变异型携带可能与PBC相关,2型EBV感染与PBC病人的DBil异常升高有关。由于PBC患病率较低,标本较难收集,尽管满足统计需求,但本研究纳入样本例数仍较少,后续尚需扩大样本量进一步研究。