苦瓜多糖和皂苷对秀丽隐杆线虫脂代谢的调节作用

贾董浩,周心雨,詹恩琪,欧阳子安,祝 莹

江苏大学 食品与生物工程学院 (镇江 212013)

随着人民生活水平的提高,高糖高脂食物摄入偏多,导致肥胖人口比例显著增高。肥胖不仅影响着人体的身心发育,还可能引发高血压、高血脂、心血管疾病、脂肪肝和糖尿病等多种慢性疾病[1]。但长期服用降脂药物的会产生肝功能损害等毒副作用。因此,从天然作物中探索具有防治脂代谢异常的有效成分将具有重要意义。

苦瓜(MomordicacharantiaL.)含有多糖、皂苷、多肽、类黄酮以及生物碱等活性成分,长期以来作为一种药食同源的食品被用来预防和改善肥胖、糖尿病等代谢综合征[2]。苦瓜多糖是一种苦瓜中重要的生理活性成分[3]。已有研究表明,苦瓜多糖具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗病毒、降血糖、降胆固醇、抗炎以及免疫调节等作用[4]。苦瓜皂苷是一种植物糖苷,存在于苦瓜的根、茎、叶及果实中,以三萜皂苷为主,具有调脂降糖的作用[5]。但对于苦瓜多糖和皂苷联合改善脂代谢、缓解脂质沉积的研究较少,为了对苦瓜资源的开发提供更科学的数据,可深入研究其活性成分联合降脂活性。

秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)是一种非寄生、可独立生存且无毒无害的线虫,具有结构简单、遗传信息清楚、基因组测序完成、生长周期短、繁殖量大、易于培养观察、无害等特点[6]。线虫脂代谢通路被证实与人类高度相似,且关键调控基因相似度极高,是一种优良的模式生物。线虫脂代谢调控的核心通路有胰岛素信号通路和 TGF-β信号通路、核激素受体介导的信号通路、转录调节因子 SREBP 调节的信号通路、5-羟色胺介导的信号通路等[7]。

因此,本实验旨在利用添加葡萄糖建立秀丽隐杆线虫肥胖模型,探讨苦瓜多糖与苦瓜皂苷联合作用对秀丽隐杆线虫脂质沉积的影响,并探究苦瓜多糖与皂苷调节脂代谢是否具有协同作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苦瓜,购自扬中绿健苦瓜种植基地;线虫 N2野生型菌株、大肠杆菌E.coliOP50,实验室保存。

油红O染色液,购于上海生工生物工程有限公司;甘油三酯(TG)和蛋白检测试剂盒,购于南京建成生物工程研究所;其他生化试剂,购自国药集团上海化学试剂有限公司。

1.2 仪器设备

体视显微镜,南京江南永新光学有限公司;多功能酶标仪,赛默飞世尔科技;正置显微镜,尼康光学仪器(中国)有限公司;线虫培养箱,上海一恒有限公司;FD-8型真空冷冻干燥机,北京博医康有限公司;超净台,苏州净化设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1苦瓜多糖和苦瓜皂苷的制备

苦瓜多糖的提取:采用热水浸提-乙醇沉淀的经典方法。称取25 g苦瓜冻干粉,95%乙醇回流2 h得滤渣,滤渣经90 ℃热水浸提3次,收集滤液,浓缩后采用Sevage法除蛋白,经醇沉、透析、冻干后即得苦瓜多糖(BPS)。

苦瓜皂苷的提取:称取苦瓜冻干粉100 g,石油醚脱脂,残渣加入75%乙醇80 ℃回流提取2次,收集滤液,用水饱和的正丁醇萃取3 次,取正丁醇相浓缩至呈褐色粘稠状时冷却,甲醇溶解后加入丙酮充分搅拌使之产生沉淀,离心,重复2 次,冷冻干燥得到苦瓜皂苷(BMS)。

1.3.2线虫培养

线虫以大肠杆菌OP50 为食,在20 ℃培养箱中培养。

线虫同步化处理:用M9 缓冲液将处于产卵期的线虫清洗至EP 管中,离心弃上清,再加入M9 缓冲液清洗两遍。洗净之后加入裂解液(0.5 mol/L NaOH 溶液和体积分数2.5% NaClO),涡旋震荡。线虫裂解充分后,离心弃上清,M9 缓冲液反复清洗3 次,将虫卵转移至20 ℃培养箱中孵育过夜得L1 期幼虫,待试验所用。

1.3.3模型的建立及试验分组

配置含100 mmol/L葡萄糖的培养基,将同步化处理的L1期线虫转到高糖培养皿上培养48 h,即可建立肥胖线虫模型[8]。试验分为正常组、模型组、BPS组(1 000 μg/mL BPS)、BMS组(100 μg/mL BMS)、BPS+BMS组(500 μg/mL BPS和50 μg/mL BMS),将BPS和BMS分别与大肠杆菌OP50菌液1∶1混匀,在高糖培养皿中加入混合液100 μL/个,将处于L1期幼虫转到各组NGM培养皿上,恒温培养48 h,即可进行试验处理。

1.3.4线虫体长和体宽的测定

BPS和BMS处理线虫48 h 后,随机挑取30条左右线虫到M9缓冲液中,60%异丙醇固定后,采用正置显微镜拍照,并用Image J对线虫体长和体宽进行定量。

1.3.5线虫运动指标的测定

BPS和BMS处理线虫48 h 后,参考白娟等[9]的方法测定头部摆动频率和身体弯曲频率。头部摆动频率:记录1 min 内线虫头部摆动次数,一个往返为摆动1次;身体弯曲频率:记录1 min 内线虫身体弯曲次数,假设以咽泵的方向规定为y轴,在爬行过程中,线虫身体沿着x轴方向完成1次正弦运动即为1个身体弯曲。每组测定30 条线虫。

1.3.6油红O染色

M9 缓冲液收集BPS和BMS处理48 h 后的线虫,离心弃上清,加入60%异丙醇脱水固定,离心弃上清,加入500 μL 油红O 染色液,室温避光震荡6～18 h后离心弃上清,加入0.01%Triton-X100,在正置显微镜下拍照。

1.3.7甘油三酯含量测定

BPS和BMS 处理同步化L1 线虫48 h 后,用M9 缓冲液洗线虫3 遍,自然沉降,弃上清,加入适量M9 重悬,超声破碎后离心取上清液。根据甘油三酯试剂盒说明书测定含量,蛋白质含量根据Bradford 蛋白浓度测定试剂盒测定。每组3 个平行试验。

1.4 数据处理

采用DPS 软件进行统计分析,结果用平均值±标准误差表示。采用ANOVA 单因素方差分析比较多组间的差异显著性,p<0.05 为具有显著差异。

2 结果与讨论

2.1 苦瓜多糖和皂苷对线虫体长和体宽的影响

秀丽隐杆线虫的基础生理指标如体长、体宽会受到食物和生长环境的影响,可反映其生长状态[10]。图1展示的是苦瓜多糖和皂苷添加后对线虫体长和体宽的影响。从图1(a)可知,添加葡萄糖后,线虫的体长显著高于正常组(p<0.05),可能是因为高糖环境刺激了线虫,导致体长应激性增加。苦瓜皂苷添加后,线虫体长显著减小(p<0.05),但苦瓜多糖不能降低高糖诱导的线虫体长增加;苦瓜多糖和皂苷联合作用后,线虫的体长有减小的趋势,与正常组线虫无显著差异,说明苦瓜多糖和皂苷对线虫的生长无抑制作用。从图1(b)可知,添加葡萄糖后,线虫的体宽显著增加,而苦瓜多糖和苦瓜皂苷单独添加或联合添加均能降低线虫的体宽,且与模型组具有显著差异。结果表明苦瓜多糖和苦瓜皂苷均能有效地降低线虫的体宽,且具有一定协同作用。

图1 苦瓜多糖和皂苷对线虫体长和体宽的影响

2.2 苦瓜多糖和皂苷对线虫运动行为的影响

线虫的头部摆动和身体弯曲是考查其运动能力的重要指标,而线虫的运动能力可以反映其能量消耗的情况[11]。从图2(a)中可看出,各组线虫的头部摆动频率无较大差异,但模型组头部摆动频率略低于正常组;而添加苦瓜多糖、苦瓜皂苷培养的线虫头部摆动频率均高于模型组。如图2(b)所示,各组线虫的身体弯曲频率有一定差异,其中模型组线虫身体弯曲频率与正常组相比也有降低的趋势,但无显著差异(p>0.05);添加苦瓜多糖和苦瓜皂苷培养的线虫身体弯曲频率均显示出高于模型组的现象,且苦瓜多糖和皂苷联合添加的线虫身体弯曲频率的升高最为显著(25.79 次数/min 对比 18.42 次数/min)(p<0.05)。以上结果表明苦瓜多糖和苦瓜皂苷均能通过增加线虫运动行为增加能量消耗,且二者联合添加时效果最优,具有协同增加线虫能量消耗的作用。预示苦瓜多糖和皂苷可能具有协同调节脂代谢的作用。

图2 苦瓜多糖和皂苷对线虫运动行为的影响

2.3 苦瓜多糖和皂苷对线虫脂肪沉积的影响

秀丽隐杆线虫的脂肪主要位于皮下组织及肠道,呈脂滴状。脂溶性染料油红O可特异性地附着于中性脂肪分子而使其呈现红色,因此可直接观察到线虫体内脂肪沉积的情况。通过油红O染色,可以初步判断脂肪沉积情况。如图3所示,与正常组相比,模型组线虫体内红色较深且染色面积较大。BPS100组和BMS100组体内红色均变浅,BPS+BMS组体内红色较浅且染色面积较小。通过Image J软件进一步分析油红O染色图像,测定线虫脂肪占比,可以较为准确的分析功能成分对线虫的脂肪沉积影响。从图4可以看出,模型组的相对脂肪含量相较正常组有显著增加(54.24% 对比62.88%);经过苦瓜多糖和皂苷处理后的线虫相对脂肪含量较模型组均显著降低(p<0.05),其中苦瓜皂苷处理过的线虫相对脂肪含量降低最明显(55.80%对比62.88%)。这表明苦瓜多糖和苦瓜皂苷均能有效减少线虫体内的脂肪沉积,且苦瓜多糖和皂苷可以联合降低线虫体内脂肪沉积。

图3 线虫油红O染色图

图4 苦瓜多糖和皂苷对线虫脂肪沉积的影响

2.4 苦瓜多糖和皂苷对线虫甘油三酯含量的影响

油红O染色结果已显示苦瓜多糖和皂苷可以协同降低高糖诱导的肥胖线虫体内的脂肪沉积,为进一步研究苦瓜多糖和皂苷的协同降脂作用,我们继续测定线虫体内甘油三酯水平。如图5所示,模型组线虫体内的甘油三酯含量明显高于正常组(0.82 mg/gprot 对比 1.69 mg/gprot),而添加苦瓜多糖和苦瓜皂苷后线虫体内的甘油三酯含量均不同程度地低于模型组(p<0.05),且添加BPS+BMS组线虫体内的甘油三酯含量最低(0.52 mg/gprot)。线虫体内甘油三酯含量的变化与线虫脂肪沉积的结果一致,均表明苦瓜多糖和皂苷可以协同调节线虫脂代谢。前期研究表明,苦瓜多糖和苦瓜皂苷均能调节HepG2细胞和线虫的脂代谢[4-5],而本研究进一步证实了苦瓜多糖和皂苷可以发挥协同降脂作用。

图5 苦瓜多糖和皂苷对线虫甘油三酯含量的影响

3 结论

综上所述,苦瓜多糖和苦瓜皂苷均对N2野生型线虫的生长无抑制作用,且能降低线虫的体宽、增加身体弯曲频率,具有一定的协同作用;同时还能减少N2野生型线虫体内的脂肪堆积,降低体内的甘油三酯含量,且二者联合添加时效果最优,具有协同调节脂代谢的作用。研究结果为我们开发以苦瓜为主要成分的降脂功能食品提供了依据。