SIRT1在M/CMCS治疗慢性牙周炎牙槽骨丢失的机制研究

尹皓云, 曹 阳, 张 婷, 范丽苑

(1.西部战区总医院, 四川 成都 610083 2.西南医科大学附属口腔医院, 四川 泸州 646000)

牙周炎是临床常见的慢性炎症性疾病之一,根据统计数据,全球范围内有超过50%的成年人患有不同程度的牙周炎,中国超过90%的成人口腔中有不同程度的牙周炎[1]。牙周炎患者临床多表现为牙龈炎症、牙周附着、牙周袋形成、牙槽骨吸收、牙齿松动或移位等,是成年人牙齿丢失的关键因素。甲硝唑为低分子硝基咪唑类药物,其在临床被广泛应用于牙周炎的治疗,具有不良反应小、安全度高、药物靶向作用强等特点。研究发现,口腔厌氧菌的感染率较高,甲硝唑类药物已成为口腔疾病如牙周病、根尖脓肿、冠周炎等抗厌氧菌感染的常规药物之一[2]。羧甲基壳聚糖是一种可自体降解、生物相容性较好的天然多糖,其不仅自身具有一定的抗菌作用,且还因安全、无毒、无害等优点被临床作为良好的口腔药物载体广泛应用。目前已有研究发现,甲硝唑羧甲基壳聚糖凝胶(metronidazole carboxymethyl chitosan topical gel,M/CMCS)可减弱牙周炎大鼠牙周组织的破骨细胞活动,但目前关于其对牙周炎大鼠牙槽骨丢失及TLR4/NF-κB信号的机制研究现有报道[3]。沉默信息调节因子1(silencing information regulator 1,SIRT1)是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性蛋白质去乙酰基酶,在能量稳态和细胞应激中起关键作用。研究发现,SIRT1可通过调控炎症通路介导牙周炎的发生发展[4]。Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)/核转录因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信号通路是炎症反应的重要传导通路之一,其可通过诱导核心肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)等炎性因子的产生,从而介导牙周炎的发生发展。因此本研究旨探究M/CMCS在治疗慢性牙周炎大鼠牙槽骨丢失及SIRT1和TLR4/NF-κB信号通路的的变化情况。

1 材料与方法

1.1实验动物:50只6周龄雄性SD大鼠,SPF级,体质量180g～220g,均购自广东来迪生物医药研究院有限公司,生产许可证号:SCXK(粤)20220-0064。饲养大鼠动物房内保持室温22℃～24℃,相对湿度55%～65%,保证房间光照12h一循环,昼夜交替,适应性喂养1周后开始实验。

1.2试剂和仪器:人牙龈卟啉单胞菌(P.gingiualis)(美国ATCC公司);SIRT1特异性抑制剂EX527(武汉美德康生物技术有限公司);苏木素、伊红(武汉华美生物工程有限公司);TLR4、NF-κB p65、SIRT1抗体、山羊抗兔HRP标记的二抗(英国Abcam公司);ELISA试剂盒(武汉博士德生物公司);蛋白测定试剂盒(美国Thermo Scientific公司);低速离心机(型号:XL-200,海门其林贝儿仪器厂);超薄型切片机(型号:EM-UC6,德国徕卡公司)。

1.3药物:甲硝唑羧甲基壳聚糖复方温敏凝胶:将甘油磷酸钠混合溶解的甲硝唑加入到甲基壳聚糖溶液中,在4℃的环境中充分搅拌,后将泊洛沙姆p407加入到混匀的溶液中,再次混匀后静置,即可获得甲硝唑羧甲基壳聚糖凝胶,其中含0.75%甲硝唑和20%羧甲基壳聚糖。0.75%甲硝唑凝胶(MNZ)购自湖北康正药业有限公司。

1.4分组及模型制备:将50只大鼠随机分为5组,即空白组(NC组)、牙周炎大鼠模型组(Model组)、Model组基础上给予M/CMCS组(M/CMCS组)、Model组基础上给予甲硝唑凝胶组(MNZ组)、M/CMCS组基础上给予白藜芦醇特异性抑制剂EX527干预组(M/CMCS+EX527组),每组10只。除NC组外,其余各组大鼠参照参考文献[5]采用牙周结扎法制备牙周炎模型,各组大鼠均腹腔注射2%戊巴比妥钠(2mL/kg)麻醉,将大鼠双侧上颌第一磨牙的牙龈缘处结扎,并于腭侧打结推至龈下,提前扩增培养密度为1×109CFU/ml的ATCC 33277人牙龈卟啉单胞菌(P.gingiualis)标准菌株菌液200μL,各组造模大鼠上颌第一磨牙结扎丝线处龈沟内用注射器环绕滴注,每日接种菌液1次,共接种3次;从实验当天起即喂养黏性高糖饮食鼠料和水,共喂养6周。NC组大鼠不做任何处理。采用牙周临床指标检查及牙槽骨吸收水平评价牙周炎模型是否成功建立。M/CMCS组大鼠在上颌第一磨牙牙龈缘处和牙周袋涂布甲硝唑羧甲基壳聚糖复方温敏凝胶;MNZ组大鼠在上颌第一磨牙牙龈缘处和牙周袋涂布2%盐酸米诺环素;M/CMCS+EX527组大鼠在上颌第一磨牙牙龈缘处和牙周袋涂布甲硝唑羧甲基壳聚糖复方温敏凝胶,同时腹腔注射EX527 10mg/kg;NC组和Model组大鼠结扎牙的牙周不涂布任何药物;各组大鼠每日早晚各涂布1次,共干预5周,EX527腹腔注射1次,共注射5周。

1.5检测牙周组织临床指标:药物干预结束后,用肉眼观察大鼠牙周组织变化,包括牙龈颜色、形状和质地,并用相机拍摄。记录牙龈出血指数(bleeding index,BI)和牙周探针深度(probing depth,PD)(分别测量上颌第一磨牙颊腭侧近中、中央和远中6个点深度,取均值)。

1.6ELISA检测血清中IL-6、IL-1β与TNF-α水平:采取眼球法取各组大鼠静脉血1mL,以每分钟3000r的速度离心,5min后收集生产呢过血清于EP管中,采用ELISA试剂盒检测血清中炎性因子水平,即IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

1.7微型计算机断层扫描(micro-CT):处死大鼠取上颌骨,去除皮肤和肌肉组织,用micro-CT扫描(70kVp、353μA电流,扫描层厚8μm),扫描结束后用CT Analyzer/CT Volume分析软件进行三维图像重建,进而评估各组大鼠牙槽骨丢失和组织损伤程度。计算各组大鼠扣除牙根后的骨体积及骨矿物质密度(BMD,g/cm3)。计算骨体积分数(%)=扣除牙根后的骨体积/总体积(BV/TV)。利用软件计算得出釉-牙骨质界(CEJ)至牙槽骨嵴(ABC)间的距离。

1.8HE染色检测各组大鼠牙周组织病理学变化:取各组大鼠牙周组织,固定于4%多聚甲醛溶液,包埋盒包埋后流水冲洗固定液,脱水并透明组织,将透明的组织用石蜡包埋,用切片机切成厚度为5μm的薄片,用苏木精水溶液染色切片,蒸馏水冲洗后酒精脱水,将切片用伊红染色3min,将切片置于显微镜下观察。

1.9蛋白质印迹法检测牙周组织中TLR4、NF-κB p65、SIRT1蛋白表达:提取牙周组织中的总蛋白,用BCA法检测总蛋白浓度。将蛋白溶液的终浓度配制为2μg/mL,将蛋白溶液置于热水中煮沸10min,后保存在-20℃冰箱中。将30μg的蛋白样品用200V电压电泳,转移蛋白样品与PVDF膜上,用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1h,将一抗(1∶500)加入到PVDF膜上,4℃孵育过夜;将PVDF膜冲洗干净后加入二抗(1∶1000),室温孵育2h。ECL放光液加入到细胞中,曝光显影后用Image Lab软件分析条带灰度值。

2 结 果

2.1各组大鼠牙周组织临床指标比较:NC组大鼠未探及深牙周袋,探针无出血,牙齿无松动;Model组、M/CMCS组、PERIO组、M/CMCS+EX527组大鼠探诊牙周袋较深且易出血,牙齿有明显松动。和NC组相比,Model组大鼠牙周探诊深度(2.28±0.21)和牙龈出血指数(3.76±0.30)均明显升高(t牙周探诊深度=19.85,t牙龈出血指数=27.60,P<0.0001);和Model组相比,M/CMCS组(0.81±0.08)、(1.24±0.12)(t牙周探诊深度=16.02,t牙龈出血指数=19.10,P<0.0001)和MNZ组(1.23±0.13)、(1.89±0.15)(t牙周探诊深度=10.40,t牙龈出血指数=13.66,P<0.0001)大鼠牙周探诊深度和牙龈出血指数均明显降低,且M/CMCS组大鼠牙周探诊深度和牙龈出血指数低于MNZ组(t牙周探诊深度=6.740,t牙龈出血指数=8.288,P<0.0001);和M/CMCS组相比,M/CMCS+EX527组大鼠牙周探诊深度(2.10±0.18)和牙龈出血指数(3.18±0.27)均明显升高(t牙周探诊深度=16.04,t牙龈出血指数=16.08,P<0.0001)(图1)。

图1 各组大鼠牙周组织临床指标比较

2.2各组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较:Model组大鼠血清中TNF-α(234.05±11.62)、IL-1β(203.62±15.31)、IL-6(181.35±11.27)水平较NC组明显升高(tTNF-α=36.66,tIL-1β=20.18,tIL-6=24.57,P<0.0001);M/CMCS组(75.81±7.54)、(93.21±8.15)、(76.81±6.32)和MNZ组(115.36±8.23)、(122.48±9.02)、(105.04±7.11)大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平低于Model组,且M/CMCS组明显低于MNZ组(tTNF-α=7.680,P<0.0001;tIL-1β=5.210,tIL-6=6.408,P=0.0002);M/CMCS+EX527组大鼠血清中TNF-α(208.54±10.81)、IL-1β(191.25±12.37)、IL-6(173.26±10.04)水平高于M/CMCS组(tTNF-α=14.55,tIL-1β=9.486,tIL-6=11.67,P<0.0001)(图2)。

图2 各组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较

2.3各组大鼠牙槽骨吸收比较:和NC组相比,Model组大鼠CEJ-ABC(615.34±51.45)距离明显增加,BMD(0.32±0.03)和BV/TV值(31.02±1.57)明显降低(tCEJ-ABC=14.63,tBMD=9.327,tBV/TV=18.17,P<0.0001);和Model组相比,M/CMCS组(276.17±27.28)和MNZ组(361.35±30.94)大鼠CEJ-ABC距离明显降低,BMD(0.54±0.05)、(0.42±0.05)和BV/TV值(45.91±2.06)、(39.87±2.41)明显升高,且M/CMCS组CEJ-ABC距离短于MNZ组,BMD和BV/TV值高于MNZ组(tCEJ-ABC=5.058,P=0.0005;tBMD=4.157,P=0.0020;tBV/TV=4.667,P=0.0009);和M/CMCS组相比,M/CMCS+EX527组大鼠CEJ-ABC(601.82±50.29)距离明显增加,BMD(0.35±0.04)和BV/TV值(35.62±1.64)明显降低(tCEJ-ABC=13.94,tBMD=7.268,tBV/TV=9.572,P<0.0001)(图3)。

图3 各组大鼠牙槽骨吸收比较

2.4各组大鼠牙周组织病理学变化比较:和NC组相比,Model组大鼠牙周组织有明显的袋状牙周袋,且CEJ到ABC的距离明显增加,牙槽骨有明显的吸收;M/CMCS组和MNZ组大鼠牙周组织CEJ到ABC的距离明显减少,且牙槽骨吸收较Model组有明显改善,M/CMCS组改善效果好于MNZ组;M/CMCS组相比,M/CMCS+EX527组大鼠牙槽骨吸收显著(图4)。

图4 各组大鼠牙周组织HE染色(×200)

2.5各组大鼠牙周组织中TLR4、NF-κB p65、SIRT1蛋白表达比较:和NC组相比,Model组大鼠牙周组织中TLR4(0.53±0.06)和NF-κB p65(0.75±0.08)蛋白表达明显升高,SIRT1蛋白(0.21±0.03)表达明显降低(tTLR4=14.72,tNF-κB p65=14.91,tSIRT1=15.25,P<0.0001);和Model组相比,M/CMCS组和MNZ组大鼠牙周组织中TLR4(0.21±0.03)、(0.28±0.03)和NF-κB p65(0.36±0.04)、(0.42±0.05)蛋白表达明显降低,SIRT1蛋白(0.72±0.08)、(0.58±0.06)表达明显升高,且M/CMCS组牙周组织中TLR4和NF-κB p65蛋白低于MNZ组,SIRT1蛋白表达高于MNZ组(tTLR4=3.429,P=0.0064;tNF-κB p65=2.295,P=0.0446;tSIRT1=3.429,P=0.0064);和M/CMCS组相比,M/CMCS+EX527组大鼠牙周组织中TLR4(0.50±0.05)和NF-κB p65蛋白(0.71±0.07)表达明显升高,SIRT1蛋白(0.25±0.03)表达明显降低(tTLR4=12.18,tNF-κB p65=10.63,tSIRT1=13.47,P<0.0001)(图5)。

图5 各组大鼠牙周组织中TLR4、NF-κB p65、SIRT1蛋白表达比较

3 讨 论

牙周炎不仅影响口腔功能,还作为糖尿病、心血管疾病、肝脏疾病、类风湿性关节炎等疾病的危险因素,对患者的生命健康造成严重的威胁。目前口腔医学领域认为羧甲基壳聚糖具有抗菌、载药缓解、再矿化、成骨和促进伤口愈合等性能,且还具有抑制口腔内重要厌氧菌生长,同时能作为骨传导性物质可以促进细胞黏附和增殖,因此在骨组织、牙体及牙周组织再生等领域广泛应用。现已开发出多种多样的制剂用于口腔治疗,如壳聚糖及其衍生物制备的药物控制缓释材料、组织再生和骨替代、抗菌材料、牙科粘合剂。国内学者发现一种羧甲基壳聚糖基抑菌凝胶不仅结构稳定,且无细胞毒性和皮肤刺激性,可通过抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌增殖发挥抑菌作用[6]。国外学者研究发现[7],壳聚糖与其他天然化合物、金属抗菌颗粒和抗生素进行功能修饰时能显现出更好的临床疗效。研究发现,添加或不添加15%甲硝唑壳聚糖凝胶对慢性牙周炎患者的临床疗效均好于单一根面平整治疗患者[8]。本研究结果显示,M/CMCS组和MNZ组大鼠牙周探诊深度、牙龈出血指数及CEJ-ABC距离明显降低,BMD和BV/TV值升高,且M/CMCS组的治疗效果明显好于MNZ组,提示M/CMCS组可促进慢性牙周炎大鼠牙槽骨重建。陈东等[9]研究证实,甲硝唑羧甲基壳聚糖凝胶对大鼠牙周炎有抗炎和抗牙槽骨吸收作用,其机制可能和降低龈沟液和牙周组织中IL-1β表达有关。炎症反应是牙周致病菌免疫反应的主要组成部分,可通过调节牙槽骨代谢介导牙周组织病理改变。TLR4是研究较广泛的炎症信号通路,激活的TLR4信号通路可磷酸化和髓样细胞分化蛋白88(MyD88)的C末端链接形成的复合体,从而激活NF-κB并使其处于游离状态的NF-κB p65,NF-κB p65可通过进入到炎性细胞核内促进下游IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子的释放,进而通过正反馈反应进一步活化NF-κB,使炎症因子持续释放。TLR4/NF-κB信号通路下游炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α等与破骨细胞分布具有一致性,当炎症因子大量释放时会促进破骨细胞的增加,从而引发炎症性骨吸收而不利于正畸牙健康且高效移动。IL-1β、IL-6、TNF-α可介导慢性牙周炎的发生发展,是慢性牙周炎的局部促进因素。本研究结果显示,M/CMCS可抑制牙周炎大鼠牙周组织中TLR4、NF-κB p65蛋白表达及IL-1β、IL-6、TNF-α水平,提示甲硝唑羧甲基壳聚糖凝胶可能通过抑制牙周炎大鼠TLR4/NF-κB信号通路而发挥促组织修复作用。王艳红等[10]研究证实,抑制牙髓炎大鼠TLR4/NF-κB信号通路激活,可通过抑制炎症反应促进大鼠牙周组织修复。

SIRT1是去乙酰基酶之一,其可调控多种细胞的生物学活性,现已有研究证实其可参与牙周炎的发生发展。SIRT1通过NF-κB去乙酰化降低炎症介质TNF-α水平,从而介导炎症的发生发展。Li等[11]研究发现,TLR4可介导革兰阴性菌的LPS引起的hPDLCs的炎症反应以及牙槽骨的破坏,通过质粒转染上调SIRT1的表达可通过降低TLR4表达及抑制JNK/NF-κB通路缓解由LPS引起的炎症反应,敲除SIRT1可促进细胞凋亡。本研究结果显示,M/CMCS可增加牙周炎大鼠牙周组织中SIRT1蛋白表达,因此猜测M/CMCS可能通过上调牙周炎牙周组织中SIRT1表达抑制TLR4/NF-κB信号通路,通过抑制炎症反应促进牙周炎大鼠牙周组织修复。为了证实这一观点,本研究采用SIRT1特异性抑制剂EX527联合M/CMCS共同干预牙周炎大鼠,结果显示,EX527可减弱M/CMCS对牙周炎大鼠牙周组织的修复作用。

综上所述,甲硝唑羧甲基壳聚糖凝胶可促进慢性牙周炎大鼠牙槽骨重建,修复牙周组织,其作用机制可能和增加牙周组织中SIRT1表达,从而通过抑制TLR4/NF-κB信号通路来抑制炎症反应实现的。