淫羊藿多糖提取、分离纯化、结构特征和生物活性研究进展

邢中夫,于慧,万新焕

(山东中医药大学药学院,山东 济南 250355)

淫羊藿(EpimediumbrevicornumMaxim.)是小檗科(Berberidacea)淫羊藿属(Epimedium)草本植物,在很多古代药籍中均有记载。淫羊藿又名仙灵脾、弃杖草,始载于《神农本草经》,常生于林下、沟边灌丛中或山坡阴湿处,其产地主要为四川、陕西、贵州、湖南等地[1]。淫羊藿中化学成分主要分为黄酮类、多糖类、生物碱类等[2],具有补肝肾、抗氧化、衰老、肿瘤等功效,并且在机体内具有强筋骨、调节免疫等临床治疗作用[3-8],临床应用十分广泛。文献表明,中药材淫羊藿主要有淫羊藿、朝鲜淫羊藿、箭叶淫羊藿、巫山淫羊藿、粗毛淫羊藿、柔毛淫羊藿等类别的干燥叶[9],其差别主要体现在形态与性质,如朝鲜淫羊藿中多糖成分的含量与抗氧化活性要明显高于其他种类[10]。淫羊藿多糖(Epimediumpolysaccharides,EPS)是对淫羊藿药材进行分离获得的具有活性的杂多糖,是淫羊藿物质基础的主要组分之一,现代研究表明淫羊藿多糖具有多种丰富的生物活性,如调节自身免疫力、抗病毒、抗衰老、抗氧化、抗辐射等生物活性[11-16]。文章基于淫羊藿多糖的提取分离、纯化方法、生物活性以及结构等方面的研究进展完成综述,为淫羊藿多糖的进一步的使用开发提供一定的理论依据。

1 淫羊藿多糖的提取、分离、纯化

1.1 淫羊藿多糖的提取

1.1.1 水提法水提法是以水作为溶剂进行提取,是一种传统的多糖提取方式,经过热水浸煮将多糖提取出来,由于多糖不溶于乙醇,可通过醇沉将多糖提取出来。鲁静等[17]采用了均匀设计法,试验考察因素选择了多糖提取的料液比、提取时间、温度、次数,以多糖得率为指标,对淫羊藿多糖热水浸提工艺进行优化。另外在传统水提醇沉淫羊藿多糖的基础上,进行了Box-Benhnken中心组合试验,采用单因素试验,对提取时间、温度和料液比进行了考察[18],从而优化了提取工艺,提高淫羊藿多糖的提取效率。此外,还有通过研究料水比、提取温度、时间、次数等,采用四因素三水平正交优化试验对该淫羊藿多糖的提取工艺进行优化[19]。水提法的试验成本相对低廉,工艺流程简单,比较适用于工业生产,但工序时间长,耗醇量大,且提取率相对较低。

1.1.2 微波辅助提取法微波辅助提取法是利用微波进行物质萃取,在微波反应器中使用适合的溶剂来提取各种所需的化学成分。孙永杰等[21]通过单因素实验确定了淫羊藿多糖的提取最佳工艺条件,研究表明,在微波法对淫羊藿多糖提取含量的3个影响因素中,影响从大到小分别是微波功率、提取时间、提取料液比。另一种是在试验中以提取物的含糖量为考察指标[22],通过单因素及正交试验来对比研究水浴及微波辅助提取淫羊藿多糖的最佳工艺。微波辅助提取法能够提高反应速度,具有更高的选择性,同时能够保持多糖原有的生物活性和功能特性,获得具有更高黏度和溶解度的多糖,获得具有更优越构型变化的多糖。相对于传统的多糖提取技术,微波辅助提取法具有选择性好、提取速度快、产品质量好等优点。

1.1.3 酶提取法酶提取法是指用酶来辅助提取多糖,酶可以加速样品中多糖成分的释放和提取,从而提高多糖的提取率。王超[23]使用纤维素酶水解对于淫羊藿多糖进行提取,采用了单因素实验和正交试验,对其提取工艺进行优化。采用纤维素酶辅助热水浸提法从淫羊藿中提取淫羊藿多糖[24],进行了单因素试验与响应面设计来进行分析酶浓度、温度、时间3个因素对淫羊藿多糖含量的影响。经试验表明,对于多糖含量影响最大的为酶提温度。与传统的多糖提取方法相比,酶提取法的优点主要为反应速率快、杂质易除、得率高等。

1.1.4 超声波辅助提取法超声波辅助提取法是利用超声波来促使提取剂向同液界面扩散,能够使原料与溶剂混合更加均匀,从而提高多糖的得率。孙永杰等[21]使用乙醇与蒸馏水作为提取剂,进行了单因素试验,考察因素选取淫羊藿多糖的提取时间、提取温度、提取料液比,再进行正交试验法优化提取淫羊藿多糖结果。潘佳[25]采用超声波水提法来进行提取淫羊藿叶多糖,并利用了正交试验法优化了淫羊藿多糖的提取条件。试验利用超声技术从干的淫羊藿叶中提取淫羊藿多糖[26],在超声辅助下,采用了响应面法分析了3个原因对该物质提取程度的影响,影响成都从大到小超声功率、温度、超声时间。超声波辅助提取法是一种高效实用的多糖提取方法,能够降低反应温度,提高反应速度,且能使提取具有选择性,与传统的多糖提取法比,提取效率较高且耗能较低。表1对于淫羊藿多糖提取方法里的工艺、得率及提取效果进行总结。

表1 常见的淫羊藿多糖提取方法及效果

1.2 淫羊藿多糖的分离纯化淫羊藿多糖的粗提取物中含有多种成分,提取淫羊藿多糖之后要除去其中的蛋白质、杂质、色素等其他物质,从而获得纯度较高的淫羊藿多糖。

1.2.1 淫羊藿多糖的脱蛋白多糖脱蛋白主要使用酶法、Sevage法、氯化钙法、盐酸法等方法。郑晓翠等[27]对比了Sevage法、氯化钙法、盐酸法等方法,得知Sevage法蛋白脱出率最高,脱出率为68.71%,且多糖损失率仅为21.25%。虽然Sevage法蛋白的脱出率较高,且糖损失率最低,但该法所用试剂氯仿具有毒性。张曜武等[28]采用木瓜蛋白酶法去除淫羊藿多糖中的蛋白质成分,通过考察了酶用量、温度、pH及酶解时间等因素对蛋白质脱除效果的影响,得到的酶法适用工艺条件为木瓜蛋白酶液占底物料液体积的10%,温度55 ℃,pH 6.0,酶解1 h。在此条件下,蛋白去除率可达90%,多糖的损失率为16%。

1.2.2 淫羊藿多糖的脱色常用的多糖脱色方法主要有活性炭、H2O2、树脂、Al2O3柱层析、聚酰胺、壳聚糖脱色等[29]。

罗小燕[30]在单因素研究基础上,设置脱色率为指标,选择正交设计试验进行筛选,最优脱色工艺为ads-7大孔树脂进行动态吸附180 min、淫羊藿多糖供试液设置上样浓度0.33 g·mL-1、上样量等于1.5倍柱体积,流速保持1 mL·min-1,过滤完成后收集滤液,测定多糖脱色率为63.59%。

1.2.3 淫羊藿多糖的纯化多糖纯化主要使用色谱法,包括离子交换和凝胶色谱等方法[31]。试验[25]中通过热水浸提法得来的淫羊藿粗多糖经DEAF-Sepharose fast flow阴离子交换柱和Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱进行分离纯化,得到了纯度为82.03%的均一多糖的组分,采用高效凝胶渗透色谱法测定其分子量为31.2 kDa。

2 淫羊藿的多糖分析

多糖能够在生物体内大量存在,属于如同蛋白质的大分子物质,多糖也具有一、二、三、四级结构。由于单糖的种类、连接位置等都比氨基酸的多,还存在端基异构现象,所以多糖的测定比氨基酸更复杂[32]。也正是因为多糖结构具备的多样性和复杂性导致其功能多样性。

通过水提醇沉得到的淫羊藿粗多糖,通过DEAE-52纤维素柱及Sephadex G-100分离纯化得到淫羊藿中性多糖EPS-1-1和淫羊藿酸性多糖EPS-2-1[12],采用高效凝胶色谱法、完全酸水解等方法对两种多糖进行结构解析。在试验[33]中将淫羊藿粗多糖分成极性、带电荷量和相对分子量差异化的三个纯化多糖片段:EAP-40-1、EAP-60-1和EAP-80-2。张宁[37]通过试验进行提取纯化,提取到淫羊藿粗多糖(EFPC)和纯化淫羊藿中性多糖(EFPN)以及通过Sepharose CL-6B凝胶层析分析柱进行进一步纯化的淫羊藿中性多糖(EFPN-1)。李波等[39]对提取到的朝鲜淫羊藿多糖(EFPC)进行分离纯化,纯化后有中性多糖(EFPN)和酸性多糖(EFPA),并进行进一步的多糖结构分析。康亦姜[40]使用了纤维素(DEAE-52)柱和葡聚糖凝胶(Sephadex G-150)柱完成淫羊藿多糖分离纯化,并分析研究其主要成分。

表2为对已知多糖结构分析的来源、纯化方法、分子量、单糖组成等进行总结。

表2 已知的淫羊藿多糖的组成

3 淫羊藿多糖的生物活性

3.1 抗氧化在实验[41]中发现,50%乙醇沉淀获得的淫羊藿多糖对于清除DPPH与ABTS自由基有较好的作用,其IC50值分别为0.42 mg·mL-1和0.54 mg·mL-1,使用200～800 mg·(kg·d)-1范围的淫羊藿多糖进行处理,实验结果表明,当浓度增加,淫羊藿多糖对于DPPH的自由基的清除率也在增加。由此得知淫羊藿多糖可以提升机体清除自由基的效率,降低脂质过氧化的发生。张宁[37]从金属离子螯合、清除以及抑制自由基还有还原能力等对比研究朝鲜淫羊藿中性多糖(EFPN),使用Sepharose CL-6B凝胶层析分析柱继续纯化所获得的朝鲜淫羊藿中性多糖(即为EFPN-1)。实验结果表明EFPN、EFPN-1能够在0～8 mg·mL-1范围内有效清除羟基自由基,还发现EFPN-1清除率高达90.05%,超过了EFPN。在DPPH法中,EFPN、EFPN-1在0.05～0.4 mg·mL-1浓度范围内有着良好的清除作用,EFPN-1清除率达到了76.68%。抗氧化实验表明,经纯化过后的朝鲜淫羊藿中性多糖EFPN-1具有较强的抗氧化能力。通过向小鼠腹腔注射大剂量的D-半乳糖构建衰老模型[10],与空白组相比,给药10、100、200 mg·kg-1的淫羊藿多糖组显著提高了小鼠血清和肝脏中超氧化物歧化酶、过氧化氢、还原性谷胱甘肽、谷胱甘肽过氧化物和谷胱甘肽-S-转移酶活力,显著减少了MDA含量,表明朝鲜淫羊藿多糖可以发挥良好的体内抗氧化作用。

3.2 免疫增强树突状细胞是目前发现的功能最强的抗原呈递细胞,其可以提供信号用来进行免疫应答,从而激活T细胞[42]。杨艳君等[12]采用流式细胞术检测淫羊藿中性多糖EPS-1-1与淫羊藿酸性多糖EPS-2-1,发现二者能够促进骨髓来源的小鼠树突状细胞中的CD86、CD80、CD40以及抗原递呈分子MHC-Ⅱ的表达,从而促进骨髓来源的小鼠树突状细胞的成熟,激活细胞的免疫应答,发挥免疫调节作用。

通过研究淫羊藿多糖对鸡外周血淋巴细胞增殖及细胞因子分泌的影响[14],结果表明,在1.221～19.53 μg·mL-1浓度条件下,淫羊藿多糖可以单独或协同PHA显著推动淋巴细胞增殖以及淋巴细胞分泌细胞因子,提高细胞免疫。

3.3 抗病毒通过实验[43]研究发现,淫羊藿多糖经硫酸化修饰后,对鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)进行鸡胚成纤维细胞(CEF)感染期间具备一定抵抗感染作用。吕岫华等[44]采用免疫酶的方法进行试验,实验结果表明,在0.78～12.5 μg·mL-1剂量范围的淫羊藿多糖对人类疱疹病毒早期抗原激活均有抑制作用。在小鼠实验[45]中,研究淫羊藿多糖是否能够对甲型H1N1流感病毒裂解疫苗存在免疫佐剂效应,结果表明,小鼠对H1N1的免疫应答在淫羊藿多糖的作用下有一定程度的增强。

综合相关文献所述,可以得知淫羊藿多糖具有一定程度的抗病毒作用,但相关文献的发表时间较早,近几年来对于淫羊藿多糖的抗病毒作用的相关研究较少,具体相关实验仍需进一步研究。

3.4 抗衰老在实验[10]中向小鼠腹腔内注射大剂量的D-Gal来建立衰老模型,分别使用10、100、200 mg·kg-1剂量的淫羊藿多糖进行实验,与空白组相比较,衰老模型小组里的小鼠记忆力都明显下降,集中表现为小鼠的潜伏期缩短且错误的次数增多。与衰老模型组比,给药组均显著增加了小鼠潜伏期,通过大量避暗实验与跳台实验,小鼠的错误次数在显著地减少。由此可见,淫羊藿多糖具有一定程度的抗衰老作用,但目前实验只停留在小鼠实验中,尚未进行人体实验。

3.5 降血糖糖尿病属于一种代谢疾病,其主要特征是高血糖。并且最近一段时间的发病率持续增加,但是以西药为主的治疗手段具备一定程度的副作用,这导致人们开始关注天然活性物质。其中多糖具备安全、低毒以及多种生物活性等特点,尤其是降血糖活性作为多糖重要活性之一,极具开发潜力[46]。

乔春雷[41]研究发现,乙醇体积分数为50% (EbLPⅡ)的淫羊藿多糖对于α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用,IC50值分别为24.0 mg·mL-1和1.1×10-1mg·mL-1。用不同剂量的EbLP Ⅱ对糖尿病模型小鼠进行21 d的治疗实验,得到的结果为EbLP Ⅱ灌胃组模型小鼠的空腹血糖值(FBG)和糖化血清蛋白含量(GSP)快速下降(P<0.05),基本维持在正常水平。

综上可知,淫羊藿多糖具有较好的降血糖活性,在缓解糖尿病并发症、调节糖尿病患者的血糖水平方面的效果较为显著。

3.6 促进DNA合成杨娟[47]使用通过水酶法提取的淫羊藿多糖进行实验,通过凝胶电泳实验发现,淫羊藿多糖对于由氧化应激引起的DNA损伤具有一定的保护作用。

由于羟基脲导致“阳虚”的小鼠,在淫羊藿多糖的作用下,刘福春等[48]进行实验研究其骨髓细胞增殖率与DNA合成率,在实验中,使用100 μg淫羊藿多糖对1×106个细胞处理后,骨髓细胞的增殖率增加了72%,DNA合成率提高了88%。

3.7 对肝脏的保护潘佳[25]通过研究发现,400 μg·mL-1剂量组的淫羊藿多糖(EFPS)可以较为显著的提升ADH的活性,可以降低乙醇在肝细胞中的积累,在改善酒精性脂肪肝方面具有较好的功效。赵金椽等[49]通过对寒凝血瘀的雄性SD大鼠来进行实验研究来探讨淫羊藿多糖对于肝脏基因表达的影响,实验结果表示,与模型组相比,EFPS组的肝脏基因表达变化表现为免疫回调、激素调控和基因表达调控发生改变,确定其具有一定程度的肝脏保护作用。

3.7 其他张乐等[50]通过实验研究观察淫羊藿多糖(EPS)对再生障碍性贫血(AA)小鼠骨髓造血功能的作用,与模型组相比,以100 mg·kg-1EPS灌胃的EPS组的小鼠的外周血Hb水平及RBC、WBC、PLT数均明显升高(P<0.05),由此得出结论:EPS能够促进AA小鼠骨髓造血功能恢复。

慢性苯(BZ)暴露会导致进行性骨髓衰竭(BMF),通过小鼠实验发现,使用淫羊藿多糖治疗可以通过增加CD3+、CD4+T细胞计数和CD4+/CD8+的比率来改善T细胞介导的免疫抑制[51]。

4 构效关系

多糖结构能够决定功能以及其生物活性。分子量能够直接影响淫羊藿多糖生物活性,分子量存在差异的淫羊藿多糖,其抗氧化活性也不相同,通过酒精梯度分级、层析法等将淫羊藿多糖分成了3个片段EAP-40-1、EAP-60-1、EAP-80-2[12],3种片段的相对分子量分别为138、114、65 kD,根据试验,虽然3种多糖片段均具有一定的抗氧化能力,但其中EAP-40-1具有最高的DPPH自由基清除能力、羟基自由基清除能力和铁离子还原能力,而EAP-60-1的ABTS自由基能力清除能力、抑制红细胞溶血以及膜脂过氧化能力明显超过另两种。EAP-80-2抗氧化能力较低,且没有明显的抑制膜脂过氧化能力。

此外,不同官能团的引入可改变多糖的生物活性。据研究显示,对硫酸酯化修饰的淫羊藿多糖(EPS)展开红外光谱分析发现[52],EPS和硫酸酯化淫羊藿多糖(sulfated EPS,sEPS)都存在着多糖母体特征吸收峰,EPS之前的抗病毒活性比较低,在进行硫酸酯化后其活性得到明显的提升,且sEPS能够有效地减少病毒对细胞吸附作用,导致病毒的释放受到影响,从而产生了抗病毒效应,还能够直接的杀灭病毒。

多糖的空间构象对其活性也有着影响。经水提醇沉得到的淫羊藿粗多糖(EFPC),经过纯化和进一步纯化后得到朝鲜淫羊藿中性多糖(EFPN)与朝鲜淫羊藿中性多糖(EFPN-1)[36]。通过甲基化分析等分析方法,研究出EFPN-1结构是将(1→4)-α-Glcp和(1→4,6)-α-Glcp当作结构的主链,(1→3,6)-α-Galp当作该结构的分支,末端残基是Ara、Gal、Rha的均一性杂多糖。在0～8 mg·mL-1范围可以有效清除羟基自由基,清除比例高达90.05%。在0.05～0.4 mg·mL-1浓度内的EFPN、EFPN-1能够有效地清除DPPH,EFPN-1清除率比例可以提升到76.68%。EFPN、EFPN-1在FRAP法中FRAP值分别可以达到4.40、7.04 mmol FeSO4/g。由此得知由于其链构象不同,相较于EPFN,EFPN-1具有更强的抗氧化能力。

5 展望

淫羊藿多糖具有提高抗氧化、抗病毒、抗衰老、降血糖的能力,能促进DNA的合成、肝脏干细胞的增殖、血小板的凝集。

展望淫羊藿多糖的进一步研究进展,主要从以下方面入手:①淫羊藿多糖具有降血糖、抗衰老、抗病毒等功能,但现阶段的实验基本都是围绕对小鼠、大鼠、鸡等动物的医学实验,应加快其对于人体的医学作用方面的研究;②应加强对于淫羊藿多糖结构方面的研究,如其单糖分析、结构与其生物活性之间的关系等方面的研究;③淫羊藿多糖是中药材淫羊藿的主要组成部分,但相比于淫羊藿的其他成分淫羊藿苷与黄酮类等,淫羊藿多糖的研究尚不够深入,而且淫羊藿多糖有着多种较优的生物活性,应对淫羊藿多糖的研究投入更多的精力;④进行多次准确实验,优化淫羊藿多糖提取分离纯化等制备步骤,寻找适合淫羊藿多糖工厂化生产制备的生产工艺技术;⑤对淫羊藿多糖分子进行改性、修饰,以强化其已知的生物活性。