2株生防菌共培养发酵液对玉米纹枯病菌的抑制作用及对玉米幼苗的促生效果

周 慧, 储 格, 段海明*, 杨胜雨, 陈 甦, 张 健

(1.安徽科技学院 资源与环境学院,安徽 凤阳 233100;2.安徽科技学院 农学院,安徽 凤阳 233100)

玉米是中国三大粮食作物之一,在粮食保供、饲料提质、生物基制造等方面发挥不可替代的作用,已成为必需的重要战略物资[1]。随着国家“新一轮千亿斤粮食产能提升行动”的推进,如何持续保证玉米产能的提升仍是重要的研究课题,其中高效防病、促生菌的筛选和利用对于保障玉米的安全、可持续生产提供重要支撑[2]。因此,以生防菌的筛选利用为主兼顾促生的绿色投入品的研发符合生态低碳农业的发展方向,具有重要现实意义。

玉米纹枯病由立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)引起,属于典型的土传病害,在高温潮湿地区发病严重,一度造成玉米产量巨大损失。目前,玉米纹枯病的防治措施主要以筛选抗性品种和化学药剂防治为主,但高抗品种缺乏,化学合成药剂对生态环境和人畜健康具有较强的损害作用[3-5]。对环境友好的生物防治已成为当今农业绿色转型发展的研究热点[6]。据报道,枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)菌株“515-126”对田间玉米纹枯病防效达49.37%[7]。解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)gfj-4发酵上清液(40.00 μL/mL)对玉米纹枯菌抑制率为40.6%[8]。张芬芬等[9]分离到1株铜绿假单胞菌属(Pseudomonasaeruginosa) ZX-2020,玉米幼苗接种后与不用溶磷菌处理相比,其幼苗根、茎生物量分别增加54.49%和26.96%。杨珍福等[10]用烟草内生解淀粉芽孢杆菌YN42的发酵液灌根玉米,30 d后玉米苗地上部鲜重增加61.42%。杨华等[11]发现玉米接种施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri) A1501的生物量比不接种植株提高24.8%。综上,对玉米纹枯病的生物防治以及益生菌对玉米的促生效果以单株菌的效果研究较多,不同菌株共培养发酵针对玉米纹枯病病菌抑制活性和促生活性的报道很少。因此,本研究开展2株芽孢杆菌的共培养发酵的防病促生研究,旨在筛选出对玉米纹枯病菌抑制活性高又对玉米具有促生作用的共培养发酵组合,从而为玉米的高产稳产提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株和玉米品种 枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)24-2、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)26-2、玉米纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)、玉米品种(安科985)(皖审玉20221009)由安徽科技学院农学院实验室保存。

1.1.2 供试培养基 PDA培养基、NA培养基、NB培养基和NYD培养基[12-13]。

1.1.3 主要仪器 DHZ-DA恒温振荡器(苏州培英实验设备有限公司);H4-21KR高速冷冻离心机(湖南可成仪器设备有限公司);721N可见分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司);RGD-1500D3LED冷光源人工气候箱(合肥右科仪器设备有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 2株芽孢杆菌对玉米纹枯病菌的抑制效果 采用平板对峙法[14],先用接种环挑取纯化后的芽孢杆菌菌苔接入距PDA平板中心相互垂直2 cm的4点处,间隔12 h再接种玉米纹枯病菌菌饼(直径7 mm)至平板中心,以不接细菌的平板为对照,置于26 ℃恒温培养箱中培养,待对照病菌长满培养皿后,分别测定生防菌对峙培养的玉米纹枯病菌直径,计算抑制率,每个处理重复3次。抑菌率(%)=(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-病菌直径)×100%。取抑菌圈部位菌丝进行10×40显微拍照,观察菌丝受抑制情况。

1.2.2 不同种子液接种比例制备无菌滤液对病菌的抑制活性 采用牛津杯法[15]将2菌株分别接入50 mL NB培养基中于恒温振荡器以140 r/min、33 ℃摇培,24-2和26-2的摇培时间分别用优化后的10、12 h制备种子液,以10 000 r/min、4 ℃离心10 min除去上清得发酵菌株,再用灭菌水洗涤3次,最后用灭菌水重悬,分光光度计调菌悬液值OD600=1.0。2种生防菌的菌悬液按10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9、0∶10的比例混合,以1%(体积比)接入装有25 mL NYD培养基的150 mL三角瓶,130 r/min,33 ℃摇培72 h,发酵液以10 000 r/min、4 ℃离心15 min,得到上清液过0.22 μm微孔滤膜除菌。在PDA平板中心接病菌,距中心1 cm同一直线上各置1个牛津杯,每杯注入200 μL无菌滤液,以加入200 μL无菌水为对照,每个处理重复3次,置于26 ℃恒温培养箱中培养36 h,测量玉米纹枯病菌直径,抑菌率同1.2.1节。

1.2.3 2种抑菌优势组合对玉米幼苗根长、叶长和根冠比的影响 将制得种子液分别按照2∶8和1∶9的接种体积比接种到装有25 mL NYD培养基的三角瓶中,以1.2.2节的方法摇培得到2菌株共培养发酵液及2株单菌发酵液。将安科985玉米种子置于26 ℃恒温恒湿培养箱中催芽48 h,然后选取芽长一致萌发良好的种子移入装有灭菌细砂的塑料花盆(高85 mm,上口径100 mm)。然后分别以24-2、26-2、24-2和26-2(接种体积比2∶8)、24-2和26-2(接种体积比1∶9)的共培发酵液为不同处理,每盆浇灌稀释8倍的发酵液30 mL,NYD原液为对照,灭菌水为空白对照,每个处理重复6次。然后置于人工气候箱(光照12 h,光强4 000 lx、黑暗12 h)培养箱培养至3叶1心期。采用直尺测量玉米叶长和根长,采用游标卡尺测量茎粗。然后轻轻抖落地下根部砂子,取出完整的根系用清水洗净,80 ℃下烘干至恒重后称地上部和地下部重量并计算根冠比[16]。

1.2.4 最佳组合共培养发酵液灌根对玉米幼苗生长特性的影响 按照上述方法分别制备生防菌24-2、26-2、24-2和26-2(接种体积比为2∶8)的共培发酵液,分别稀释2倍、4倍、8倍、12倍、16倍和24倍,以NYD原液为对照,以灭菌水为空白对照。每个处理重复6次。培养至3叶1心期,采用叶绿素仪SPAD520 Plus测量叶绿素值,采用1.2.3节的方法测量株高、茎粗、地上部干重、地下部干重、计算根冠比、壮苗指数[17]及各指标隶属函数值[18]。

1.3 数据处理

数据利用Excel 2013和SPSS 25.0软件进行数据处理和分析。

2 结果与分析

2.1 2株芽孢杆菌对玉米纹枯病菌的抑制效果

由图1可见,对峙培养试验显示枯草芽孢杆菌24-2和解淀粉芽孢杆菌26-2对玉米纹枯病菌的抑制效果均较为显著,计算得出,24-2和26-2对玉米纹枯病菌的抑制率分别为86.55%±5.24%和78.43%±5.86%。挑取抑菌圈边缘菌丝进行显微观察发现,病菌对照菌丝伸展正常,表面平滑,而24-2与26-2处理的菌丝表面粗糙,色素沉积,部分菌丝严重畸形,出现断裂、凹陷现象,可以看出,菌株26-2对玉米纹枯病菌菌丝的破坏作用更为显著。

注:A、B分别为24-2、26-2对病菌的对峙培养效果,C为对照;D、E分别为24-2、26-2对峙培养后的显微拍照效果,F为对照。

2.2 2个生防菌株不同接种比例的共培养发酵无菌滤液对玉米纹枯病菌的抑制效果

由表1可知,2菌株按不同接种比例共培养发酵得到的无菌滤液对玉米纹枯病菌的抑制效果明显不同。2∶8比例对病菌的抑制率最高,为39.34%(P<0.05),1∶9比例的抑菌率为37.21%。因此,选定2∶8和1∶9的接种比例作为下一步的研究对象。

表1 不同接种比例共培养发酵滤液对玉米纹枯病菌的抑制率

2.3 2种抑菌优势组合对玉米幼苗叶长、根长和根冠比的影响

由图2所示,生防菌株24-2、26-2和共培养发酵培养的处理叶长均大于NYD培养基和CK,单菌之间差异不显著(P>0.05);根长以2∶8共培养处理为最高是CK的1.24倍,说明供试的2个生防菌株及其共培养发酵组合能够显著促进玉米幼苗叶和根的生长。从图3可见,24-2、26-2的根冠比较CK分别提高了17.16%和19.32%,且以2∶8为最高,分别高出NYD培养基和CK 37.82%和47.40%。1∶9共培养发酵组合低于2∶8组合13.01%。综上,以2∶8共培养发酵液的促生效果最佳。

注:24-2、26-2为单菌发酵液,2∶8、1∶9为共培养发酵,NYD、CK为对照。下同。

图3 不同处理对根冠比的影响Fig.3 Effects of different treatments on root-shoot ratio

2.4 最佳组合所得发酵液灌根对玉米幼苗叶绿素、株高、茎粗及干重的影响

由图4可知,不同处理发酵液灌根对玉米叶绿素SPAD值均随着发酵液稀释倍数的升高,叶绿素含量均表现为先上升后下降的趋势。24-2的发酵液稀释16倍的SPAD值最高,为28.13;26-2稀释12倍达最高值为28.18,比CK高8.33%。处理2∶8的12倍稀释液达最高为28.25,比CK高8.59%。

图4 不同稀释倍数处理对玉米幼苗叶绿素SPAD值的影响Fig.4 Effects of different dilution times on chlorophyll SPAD value of maize seedlings

由图5可知,生防菌处理优于NYD处理和CK,2∶8共培养发酵液稀释12倍的株高为28.95 cm,分别比24-2、26-2高7.49%和7.09%;最低的是NYD稀释24倍液处理的株高为25.33 cm。

图5 不同稀释倍数处理对玉米幼苗株高的影响Fig.5 Effects of different dilution times on plant height of maize seedlings

由图6可知,单菌与共培养发酵的茎粗较CK都有所提高,最高值为2∶8共培养发酵的茎粗达2.74 mm,比CK高12.20%。说明菌株发酵液浓度过高或过低均对幼苗生长不利,应根据不同作物确定不同的发酵菌液施用浓度。

图6 不同稀释倍数处理对玉米幼苗茎粗的影响Fig.6 Effects of different dilution times on stem diameter of maize seedlings

由图7可知,26-2、2∶8共培养发酵处理的地上部干重均随稀释倍数上升表现为先升后降。发酵液稀释12倍时分别是0.095 g、0.099 g,较CK分别高31.80%和36.41%。

由图8可知,地下部干重在12倍时最佳,其中2∶8处理最大为0.081 g,高出CK 55.13%。其次为单菌24-2与26-2 稀释12倍达最高值,分别为0.066 g和0.077 g。综上,共培养发酵处理对玉米幼苗的增重效果最佳。

图8 不同稀释倍数的发酵液对玉米幼苗地下部干重的影响Fig.8 Effects of different dilution times on underground dryweight of maize seedling

2.5 各指标的隶属函数值评价

从表2可见,共培养发酵表现出较好的促生效果,壮苗指数以2∶8接种比例下稀释12倍为最高,其次是2∶8稀释8倍。整体评价为2∶8共培养发酵>26-2单株菌>24-2单株菌>NYD>CK。

表2 不同浓度处理指标的隶属函数值

3 讨论与结论

目前,高抗玉米纹枯病的玉米自交系偏少,导致许多品种在生长发育后期易于感染玉米纹枯病[19]。玉米一旦被侵染则由植株下部叶鞘形成云纹状斑块,温湿度适宜时快速朝上扩展,严重者将导致整株死亡[20]。玉米纹枯病后期形成菌核落入土壤中导致翌年连续侵染,而生物防治措施在抑制病害发生和改善土壤微环境等方面具有重要作用,能够显著减轻纹枯病的发生[21]。玉米根际土壤分离的哈茨木霉(Trichodermaharzianum)T8、黄绿木霉(Trichodermaaureowiride)T2、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)T13对玉米纹枯病菌抑制率分别为84.98%、73.47%和40.61%[22]。本试验2个生防菌株24-2、26-2与玉米纹枯病菌对峙的抑制率分别为86.55%和78.43%,从对峙培养显微观察发现2个生防菌株对病菌菌丝生长均具有显著的抑制作用。同时,无菌滤液共培养发酵效果高于单菌,接种比例2∶8(V/V)抑菌率最高,达39.34%,其次1∶9为37.21%。可以看出,本研究的2个生防菌株及其共培养发酵具有潜在的生防利用价值,将进一步进行盆栽和大田试验加以验证。

强震宇等[23]从砂姜黑土分离的纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobiumcellulans)MC29,施用后玉米SPAD值、根长、总重分别提高7.6%、18.3%、21.3%。本研究24-2单菌发酵液8倍稀释灌根与纯NYD培养基相比,叶长、根长分别增加了4.69%、5.45%,26-2单菌单独灌根相较CK对玉米幼苗根冠比值提高19.32%。CK的总干重分别比24-2、26-2低13.15%、17.91%,说明菌株发酵液处理对玉米幼苗有促生效果。2个菌株共培比例2∶8、1∶9较单菌的促生效果有所加强,2∶8共发酵处理根长分别比24-2和26-2高11.49%和15.82%;1∶9叶片比24-2、26-2分别增长2.48%和4.42%,处理2∶8根冠比优于单一菌株,同时优于1∶9共培养发酵的效果,说明2∶8共培养发酵的促生优势更大。高祯蔚[24]将解淀粉芽孢杆菌ZYBAl7与多粘类芽孢杆菌ZYPP19(体积比2∶1)共培养发酵液浇灌玉米,10 d后株高高于对照34.3%,20 d后茎粗比对照增加17.2%。本研究在不同稀释浓度对玉米幼苗的灌根中发现,2∶8处理株高、茎粗与CK差异明显(P<0.05),最高值分别高出CK 13.38%和12.20%。隶属函数综合评价2∶8共培养发酵液的12倍稀释液为最优,说明2∶8共培养发酵组合具有较高的潜在利用价值,其促生机制有待于进一步阐明。