响应面法优化贝莱斯芽孢杆菌T-1的发酵条件

田凤鸣，陈强，何九军，王瀚，卓平清，王让军

（1.陇南师范高等专科学校 农林技术学院，甘肃陇南 742500；2.陇南特色农业生物资源研究开发中心，甘肃陇南 742500）

由腐皮镰孢菌（Fusariumsolani）[1]引起的花椒根腐病会导致花椒根系腐烂，叶片变小、枝条发育不全，严重时会引起整株枯死，给花椒产量和品质带来了严重影响，造成极大的经济损失．花椒根腐病的防治一直是生产上难以解决的问题，由于花椒病虫害多发，农药和化肥的使用量大，导致花椒生产存在较大的生态和食品安全隐患．生物农药因对环境和人畜无害且对植物病原菌会产生持续的抑制效果，所以在发展潜力和应用上逐渐受到科研学者的关注．田凤鸣等[2-3]针对腐皮镰孢菌筛选出了5 种高效、污染小、低毒的农药，并发现绿色木霉和哈茨木霉的复配使用对花椒根腐有着良好的拮抗作用．当前，真菌、细菌、放线菌和病毒等具有抑制病原菌生长和抗逆能力强等特点[4-5]的生防菌已成为研究重点，其中贝莱斯芽孢杆菌（Bacillusvelezensis）T-1[6]是一株在花椒根腐病的防治中具有较大生防潜力的细菌．

环境中的各种因素，如pH、温度、转速、接种量等，都会严重影响微生物的生长，合理的发酵条件试验设计会提高微生物的菌体浓度[7]．响应面法（Response Surface Methodology, RSM）用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析获取最优工艺参数[8-9]，其试验设计具有简单、快速、准确的优点，已被广泛应用在食品、生物学、农学、化学等领域．本研究以pH、培养温度、接种量、摇床转速为自变量，在前期单因素综合试验基础上，开展响应面设计分析，优化贝莱斯芽孢杆菌T-1 的发酵培养参数，确定该菌的最优发酵培养条件，进一步提高该菌的菌体浓度，以期为研究开发防治花椒根腐病的生物菌剂及应用提供可靠理论依据．

1 材料与方法

1.1 材料

1）供试菌株．贝莱斯芽孢杆菌T-1，花椒根腐病病原菌腐皮镰孢菌均由本校微生物实验室分离鉴定获得并保存．

2）供试培养基配制．①NA 液体培养基：10.0 g蛋白胨，5.0 g 牛肉膏，1.5 g NaCl，1000 mL 蒸馏水，pH 值调至6.5～7.5．②PDB 培养基：20.0 g 葡萄糖，200.0 g 马铃薯，1000 mL 蒸馏水，pH 值调至7.0～7.5．③LB 培养基：10.0 g 胰蛋白胨，5.0 g 酵母浸粉，5.0 g NaCl，1000 mL 蒸馏水，pH 值调至7.0～7.5．④BPY培养基：5.0 g 牛肉浸粉，10.0 g 蛋白胨，5.0 g 酵母浸粉，5.0 g NaCl，10.0 g 葡萄糖，1000 mL 蒸馏水，pH值调至7.0～7.5．⑤YSP 培养基：5.0 g 酵母浸粉，10.0 g 蛋白胨，10.0 g 蔗糖，1000 mL 蒸馏水，pH 值调至7.0～7.5．⑥NYBD 培养基：10.0 g葡萄糖，8.0 g牛肉浸膏，5.0 g 酵母浸粉，1000 mL 蒸馏水，pH 值调至7.0～7.5．⑦改良的BPY 培养基：5.0 g 牛肉浸粉，10.0 g 蛋白胨，5.0 g 酵母浸粉，5.0 g KH2PO4，10.0 g葡萄糖，1000 mL蒸馏水，pH值调至7.0～7.5．

1.2 试验方法

1）种子液的制备．将贝莱斯芽孢杆菌T-1 单菌落接种于LB 固体培养基中，30 ℃倒置培养24 h．挑取单菌落接种于LB 液体培养基进行摇瓶培养12 h 后，再次转接于LB 液体培养基中．通过测定其生长曲线，确定最佳对数生长期时间为21 h 的菌体发酵液为种子液．

2）前期试验结果．综合考虑成本的基础上确定该菌最适的培养基为改良的BPY 培养基，装液量为50 mL/150 mL 锥形瓶．菌T-1 利用的最佳碳源为葡萄糖，最佳氮源为酵母粉、牛肉粉、蛋白胨，最佳无机盐为KH2PO4．

3）拮抗菌贝莱斯芽孢杆菌T-1 发酵培养条件单因素试验．试验按种子液制备的方法进行培养，发酵液利用分光光度计测量其浊度，OD600值的大小表示其菌体的浓度，每次试验3 次重复，逐步筛选出各条件下最优的发酵参数．

①pH 值对贝莱斯芽孢杆菌T-1 发酵培养的影响．在综合考虑成本和前期试验的基础上，用1mol/L HCl 或NaOH 溶液将改良的BPY 培养液的pH 调为2.5～11.5，pH 段之间以1 为梯度，接种量为1%，培养温度30℃，摇床转速设置为180 r/min，进行培养21 h 后，测定OD600值，每次试验3 次重复，筛选出最佳pH．

②培养温度对贝莱斯芽孢杆菌T-1 发酵培养的影响．以最佳pH 值，设置培养温度为28、30、32、34、36、40 ℃六个梯度，接种量为1%，摇床转速设置为180 r/min，进行培养21 h 后，测定OD600值，每次试验3次重复，确定最适培养温度．

③接种量对贝莱斯芽孢杆菌T-1 发酵培养的影响．以最优pH 值，最适温度，设置接种量为1%、2%、3%、4%、5%、6%六个梯度，摇床转速设置为180 r/min，进行培养21 h 后，测定OD600值，每次试验3次重复，确定最佳接种量．

④摇床转速对贝莱斯芽孢杆菌T-1 发酵培养的影响．以最优pH值，最适温度，最佳接种量，设置摇床转速为140、160、180、200 r/min、4 个条件，进行培养21 h 后，测定OD600值，每次试验3 次重复，确定最佳摇床转速．

4）贝莱斯芽孢杆菌T-1 菌体浓度的测定．取部分1.2.1 中发酵液利用分光光度计测定OD600值，每次试验3次重复．

5）响应面设计．在单因素试验的基础上，综合考虑对菌株浓度的影响，选定A（pH）、B（培养温度）、C（接种量）、D（摇床转速）作为4 个主要考察因素并以1、0、-1表示四个因素的高低水平，以菌T-1发酵液OD600为响应值进行响应面组合试验，优化发酵培养参数、试验因素和水平（见表1）．用Design Expert 11 采用4 因素3 水平29 组试验进行响应面设计，确定最佳发酵条件．

表1 优化贝莱斯芽孢杆菌T-I发酵培养条件因素与水平的响应面设计Table 1 Response surface design for optimizing factors and levels of B. velezensis T-I fermentation culture conditions

6）数据处理．通过SPSS 分析数据，得出结果，用“平均值±标准差”表示，显著性差异比较通过单因素方差分析得出，p＜0.05 为差异显著，p＜0.01为差异极显著；用Excel作图；所有试验重复3次．

7）发酵条件验证试验．采用上述最佳发酵培养参数进行试验模型的验证，测定菌体浓度OD600值，所得结果与理论值相比，计算相对误差，证实模型的有效性，以此验证响应面法所得结果的可靠性．

2 结果与分析

2.1 单因素试验

1）贝莱斯芽孢杆菌T-1 发酵培养的最佳pH值．由图1可知：贝莱斯芽孢杆菌T-1对pH 的适应范围较为广泛，在4.5～9.5 之间均能生长，但强酸、强碱的环境明显阻碍了该菌株的生长，pH 值小于4.5时，生长极其缓慢，OD600值低至0.053，pH值大于9.5时，生长也明显受到了阻碍，OD600值仅为0.018，强酸强碱条件下，其发酵液澄清，几乎无菌体生长，综合分析，随着pH 的升高OD600出现先升后降的趋势，在pH 为6.5 时OD600最大，吸光值达1.869，因此选用6.5为最佳pH，用于后续试验．

图1 pH对贝莱斯芽孢杆菌T-1发酵培养的影响Fig.1 Effects of pH on fermentation culture of B. velezensis T-1

2）贝莱斯芽孢杆菌T-1 发酵培养的最佳培养温度．在最佳pH基础上，不同的培养温度对拮抗菌T-1 的生长影响较大（如图2），在28℃ ～ 34℃间均能很好地生长，温度过高或过低都不利于该菌株的生长，温度为30℃时生长最好，OD600可达1.811，此时的OD600均高于其他6 个温度，p＜0.05，因此选30℃为该菌培养的最佳温度，用于后续的实验．

图2 温度对贝莱斯芽孢杆菌T-1发酵培养的影响Fig.2 Effects of temperature on fermentation culture of B. velezensis T-1

3）贝莱斯芽孢杆菌T-I 发酵培养的最佳接种量．在最佳pH和最适温度的基础上，筛选最佳的接种量对拮抗菌T-1 的发酵培养的影响，由图3 可知：接种量对拮抗菌T-1 的影响较大，随着接种量的增加，拮抗菌T-1 的OD600出现由升后降的现象，从经济和综合考虑4%为该菌的最佳接种量，OD600可达1.926．

图3 接种量对贝莱斯芽孢杆菌T-1发酵培养的影响Fig.3 Effects of inoculum size on fermentation culture of B. velezensis T-1

4）贝莱斯芽孢杆菌T-1 发酵培养的最佳摇床转速．由图4 可知，发酵液OD600随着转速的增加表现为先升后降，转速在180 r/min 时，OD600可达1.883，在200 r/min 时，其发酵液OD600结果次之，可达1.868，因此，将180 r/min确定为最佳摇床转速．

图4 转速对贝莱斯芽孢杆菌T-1发酵培养的影响Fig.4 Effects of rotational speed on fermentation culture of B. velezensis T-1

2.2 响应面法试验结果

拮抗菌T-1 发酵培养条件的优化工艺在前期试验基础上考察A（pH）、B（温度）、C（接种量）、D（摇床转速）单因素试验基础上开展，按照4因素3水平的二次回归拟合及方差分析，结果见表2、表3．研究各试验因子对拮抗菌T-1 发酵培养的影响，通过响应面统计分析得出的回归模型为：

表2 贝莱斯芽孢杆菌T-1发酵培养条件响应面模型及方差分析Table 2 Response surface model and variance analysis of B. velezensis T-1 fermentation conditions

表3 贝莱斯芽孢杆菌T-1响应面设计及实验结果Table 3 Response surface design and experimental results of B. velezensis T-1

由发酵条件模型分析及方差分析结果可知，回归模型极显著（p＜0.01），说明模型对响应值拟合良好．A一次项（A）、B一次项（B）、二次项（A2、B2、C2、D2）和A、B、C、D的交互项（AB、AC、AD、BD、CD）都达到极显著水平（p＜0.01），一次项D对拮抗菌T-1 的OD600具有显著水平（p＜0.05），说明OD600的变化复杂，各试验因素对响应值不是简单的线性关系，试验结果表明：pH、温度、转速三个因素对拮抗菌T-1 的发酵培养工艺影响显著．失拟度为0.1666，大于0.05，说明试验点均能用模型描述．拮抗菌发酵培养工艺模型决定系数分别为R2=0.9971，说明模型的相关性很好，并能较好地进行响应值的变化分析，确定最佳发酵条件．经拟合检验后校正系数R2adj= 0.9981，两者非常接近，说明拮抗菌发酵培养响应面二次回归拟合度很好．信噪比RAdeqPrecision= 129.207，大于4，说明该模型的试验设计可靠，可信度高，预测较准确．F值的大小表明各因子对试验指标的重要性，F值越大，说明该因子越重要．由表2 可知，FB＞FA＞FD＞FC，即对贝莱斯芽孢杆菌T-1 菌株发酵的影响程度： 温度＞pH＞摇床转速＞接种量．

根据响应面法分析数据，利用Design Expert 11绘制出的响应曲面（图5-10）的陡峭与平缓直观地反映了pH 值、温度、接种量、转速四种试验因子对OD600的影响，即四个因素对花椒根腐病拮抗菌T-1发酵培养的影响．由图可见，响应曲面均为开口朝下的凸型曲面，表明响应值有着极高值；曲面坡度都比较陡峭，说明其因子之间交互作用复杂；各因素之间的交互作用对拮抗菌T-1 发酵培养的影响程度由大到小的顺序为：pH 值与转速—接种量与转速—pH 值与温度—pH 值与接种量—温度与转速—温度与接种量，其中除了温度与接种量，其余其他因素之间的交互因素对拮抗菌T-1 的OD600影响显著，这与之前的方差分析结果相符合．

图5 pH值和温度交互作用对贝莱斯芽孢杆菌T-1生长影响的响应面图Fig.5 Response surface plot of the effect of pH and temperature interaction on the growth of B. velezensis T-1

图6 pH值和接种量交互作用对贝莱斯芽孢杆菌T-1生长影响的响应面图Fig.6 Response surface plot of the effect of the interaction between pH and inoculum on the growth of B. velezensis T-1

图7 pH值和转速交互作用对贝莱斯芽孢杆菌T-1生长影响的响应面图Fig.7 Response surface plot of the effect of pH and rotational speed interaction on the growth of B. velezensis T-1

图8 转速和温度的交互作用对贝莱斯芽孢杆菌T-1生长影响的响应面图Fig.8 Response surface plot of the interaction of rotational speed and temperature on the growth of B. velezensis T-1

图9 温度和接种量的交互作用对贝莱斯芽孢杆菌T-1生长影响的响应面图Fig.9 Response surface plot of the interaction of temperature and inoculum size on the growth of B. velezensis T-1

图10 转速和接种量的交互作用对贝莱斯芽孢杆菌T-1生长影响的响应面图Fig.10 Response surface plots of the interaction of rotational speed and inoculum size on the growth of B. velezensis T-1

根据拮抗菌T-1 发酵培养条件响应曲面模型分析和方差分析结果，可以确定拮抗菌T-1 发酵培养的最佳工艺参数：pH 值为7.14、温度为30.8℃、接种量为4.01%、摇床转速为180.8 r/min，拮抗菌T-1发酵培养OD600达到1.912 8．结合生产实际情况及操作的可行性，将拮抗菌T-1 的最佳发酵条件修正为pH 7.0、培养温31 ℃、接种量4%、摇床转速181 r/min．

2.3 贝莱斯芽孢杆菌T-1发酵参数验证实验

为了再次确定该模型的后期的可靠性，对优化后的发酵参数进行了3 次验证，测定贝莱斯芽孢杆菌T-1 的OD600值分别为：1.897、1.908、1.910，平均值为1.905，与预测值1.9128 非常接近，因此，本文建立的模型效果良好，优化的发酵参数可靠，在后期生产中具有应用价值．

3 结果与讨论

利用生防细菌对植物病害进行防治已成为当今的一个研究热点[10]． 拮抗菌中将芽孢杆菌（Bacillusspp.）作为研究的重点对象．其生长迅速，能够产生抑菌的有效成分，诸如抗菌蛋白、肽等，不会污染环境，对人体也无毒害[11-12]．菌株所处的生长环境会影响活性菌的抗菌性，利用响应面法优化菌株产生抗菌活性物质的发酵参数能提高该菌株的抗菌能力[13]．2016 年以来，贝莱斯芽孢杆菌受到了研究者的关注，相关研究论文、专利呈现快速增长态势[14]，尤其是在抑制病原菌和生物防治方面的研究占据优势．

发酵培养基是微生物繁殖、代谢的基础，微生物数量和抗菌活性物质产量受到其培养基成分及培养条件的影响[15-16]．李姝江[17]等人利用响应面法对贝莱斯芽孢杆菌ZJ20 发酵参数进行了优化，获得最佳培养条件为：pH 7.2、转速160 rpm/min、温度28℃．甄新武[18]等人优化了贝莱斯芽孢杆菌z27 菌株培养参数，获得最佳培养基组分：豆饼粉为1.5%，MnSO4.H2O 0.07%，玉米粉为2.0%，这与本试验对贝莱斯芽孢杆菌T-1 发酵培养参数的优化结果有所不同，可能不同地域筛选出的不同菌株对培养基成分的需求和生长环境有差异．

响应面法在微生物发酵中被越来越多的应用，它是一种试验次数少、周期短、精度高，研究多种因素交互作用的试验分析方法[19-20]．本试验以改良的BPY 为培养基，装液50 mL/150 mL，在单因素试验的基础上，选定pH、温度、接种量、摇床转速为自变量，以拮抗菌T-1 的OD600为响应值，进行响应面的分析，结合生产实际得到优化的最佳发酵培养参数为：pH 7.0，温度30℃，接种量4%，摇床转速181 r/min．在此条件下发酵液OD600值达到1.9128．在后期的实验中利用此模型进行了验证，得到的OD600值为1.905，与模型预测值得到的结果相近，说明模型可用于后期的生产实践．在优化前菌落数为43.8×107CFU/mL，优化发酵培养参数后菌落数可达83.6×108CFU/mL，与优化前相比提高了19.08 倍．此结果证明响应面法在提高优化效率、增加菌量、降低成本等方面具有优良的作用，本文优化后的贝莱斯芽孢杆菌T-1 为后期生物菌剂的研发提供了新的生物资源，有望投入工业化生产中．