克罗诺杆菌分型技术研究进展

贾嫒，黄燕，宋丹靓敏，苏群超，梁雅琪，李誉，郑亚平，杨鑫焱，满朝新，姜毓君

（东北农业大学食品学院乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030）

0 引言

克罗诺杆菌（Cronobacter spp.）曾被称为阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)，是肠杆菌科下多存于人和动物肠道内的一个多样化的属，该属由7 个种组成，分别为阪崎克罗诺杆菌(C.sakazakii)、丙二酸盐克罗诺杆菌(C.malonaticus)、苏黎世克罗诺杆菌(C.turicensis)、莫金斯克罗诺杆菌 (C.muytjensii)、都柏林克罗诺杆菌（C.dublinensis)、尤尼沃斯克罗诺杆菌(C.universalis)和康帝蒙提克罗诺杆菌(C.condimenti)[1]，其中3 个种已从感染的新生儿中分离出来，分别为C.sakazakii、C.malonaticus和C.turicensis[2]。克罗诺杆菌是一种有周身鞭毛、能运动、革兰氏阴性、氧化酶阴性、过氧化氢酶阳性、兼性厌氧的食源性致病菌，广泛存在于食品和环境，尤其是婴幼儿配方乳粉(powdered infant formula,PIF)及其加工环境中。目前，感染克罗诺杆菌的大多数病例来自于摄入受污染PIF 的早产儿和低出生体重儿以及4周龄新生儿[3]，少数为免疫功能低下的老年人[4]。克罗诺杆菌感染主要引起坏死性小肠结肠炎、菌血症和脑膜炎等疾病，致死率可高达40%～80%，存活者也会出现长期后遗症，包括神经发育迟缓、脑积水和永久性神经损伤和精神残疾等[5]。近年来，我国每年约有1600万新生儿出生，其中约85 %使用PIF 喂养[6]，因摄入受污染PIF 引起婴儿感染问题却时有发生，使PIF 安全问题成为社会热点问题。2021 年，Yaylor 等[7]报告了两名因摄入受阪崎克罗诺杆菌污染的PIF 而患脑膜炎住院的婴儿，其中一名婴儿存活后听力受损。2022 年，4 名婴儿因摄入奶粉感染阪崎克罗诺杆菌，其中2 名已被证实死亡[8]。克罗诺杆菌感染事件不仅引起了广泛关注，也再次敲响了克罗诺杆菌污染的PIF 对婴幼儿造成严重生命威胁的警钟，因此提高对克罗诺杆菌的防控水平是十分必要的。

2020 年，Parra 等[9]从来自荷兰、墨西哥等4 个国家的128 个PIF 样本中分离得到6 株克罗诺杆菌。2021 年，Gan 等[10]从中国陕西婴幼儿配方奶粉及工厂环境采集的617 份样品中分离出15 株克罗诺杆菌。Gicova[11]、Zhang[12]和Brandao 等[13]分别从婴儿配方奶粉、奶粉工厂及巴西零售食品中分离出克罗诺杆菌，分离率分别为92.31 %、73.68 %和82.22 %。除PIF 外克罗诺杆菌还存在其他污染源[14]，一系列食物中曾分离出克罗诺杆菌，如面粉，坚果，蔬菜，水果，大米，干肉，调味品和海鲜[15-17]，大大增加了克罗诺杆菌的感染风险。2018 年，Moravkova 等[18]在一年时间里收集了175 份蔬菜样品，并对其进行克罗诺杆菌的分离，最终分离率为22.3 %。除食物外克罗诺杆菌在环境中的分布也很普遍，涉及土壤，水和家居环境[17,19]。2019 年，Hu 等[20]从来自土壤和水样的141 份环境样品中分离得到22 株克罗诺杆菌，其中包括6 株阪崎克罗诺杆菌。2021 年Costa 等[21]从来自美洲的465 份样品中分离出232 株克罗诺杆菌，其中102 个来自环境样品，27 株从PIF 中分离出来，1 株来自水样品。可见克罗诺杆菌在自然界中很普遍，要实现控制克罗诺杆菌的污染与危害，不仅需要开发相应的检测技术以达到溯源目的，同时也需要相应的分型技术通过对克罗诺杆菌相似性研究，来确定引起感染的菌株类型、来源与致病能力，因为并不是所有的克罗诺杆菌都具有致病性[22]。因此，了解不同来源菌株的类型对于追踪污染源和降低危害非常重要，因此本文从分型方法的原理入手，对不同分型方法的分型能力及应用现状进行比较与分析，以期为克罗诺杆菌溯源分型方法的选择提供依据。

1 分型技术概括

分型技术是根据微生物的生化或基因特征，对不同来源微生物间的种属关系进行判定的一项技术。现知的克罗诺杆菌属的分类很复杂，因为其普遍与肠杆菌科其他成员的遗传关系密切。因此，对其进行正确的分型一直是一项艰巨的任务，且克罗诺杆菌不同型别菌种之间具有一定的生物学差异[23]，所以采用更加可靠的分型方法很重要。克罗诺杆菌的分型方法可分为表型分型和分子分型两种，其中应用较早的表型分型包括生化分型、蛋白分型和血清分型等，但是克罗诺杆菌属的分型仍然需要更快速、更具成本效益和更可靠的方法。因此，这些方法目前正被基于DNA 指纹识别的技术，如脉冲场凝胶电泳（PFGE）、扩增片段长度多态性（AFLP）、多位点序列分型（MLST）、多位点VNTR 分析（MLVA）、核糖体分型、全基因组分型等分子分型方法所取代，因为它们具有更高的可靠性以及集中的开放存取数据库方法。分型结果不仅能准确反映出克罗诺杆菌的形态特征、蛋白结构、血清型等表型特征，也可以对克罗诺杆菌进行鉴定。近年来随着分子技术的进步，有多种方法可用于对不同来源的克罗诺杆菌菌株进行分型[24]，克罗诺杆菌属的分型取得了重大进展。

2 克罗诺杆菌表型分型技术

2.1 传统血清型分型

血清型分型是最早发展起来的细菌分型方法，为细菌菌株的分类提供了基础，是流行病学监测的重要工具。传统血清分型技术的原理是基于抗体抗原相互作用来确定与革兰氏阴性病原体相关的O-抗原之间的差异[25]。O-抗原是克罗诺杆菌外膜的重要组分，O-抗原结构的多样性为血清分型提供了基础。

基于PCR 的阪崎克罗诺杆菌O-型血清分型方案首次在2011 年由Sun 等[26]提出，他们将从各国食品中分离出的114 株阪崎克罗诺杆菌分为7 个血清型。2015 年，Yan 等[27]对此血清分型方法进行了扩展，通过PCR 限制性片段长度多态性分析，确定了阪崎克罗诺杆菌O-抗原编码位点rfb 的核苷酸多态性，基于对这些DNA 图谱的分析，在不同来源的62 株阪崎克罗诺杆菌中检测到12 种独特的带型，并确定了两种常见的血清型（O:1 和O:2）。2013 年，Jarvis 等[28]采用MboII限制性片段长度多态性模式和O-抗原基因簇的DNA 序列鉴定了克罗诺杆菌属的新型血清型（C.turicensisO3，C.muytjensiiO2，C.dublinensisO1，C.dublinensisO2 和C.universalis O1）。2015 年，Blaková 等[29]共检测不同来源的82 株克罗诺杆菌，通过限制性片段长度多态性（RFLP）分析确定O-抗原基因簇的核苷酸变异性，结果将其分为17 个血清型。2021 年，姜华等[30]对分离自156 份学校环境样品的11 株克罗诺杆菌进行血清型分析，结果得到的5 种不同的血清型中有3种血清型属于阪崎克罗诺杆菌，目前在克罗诺杆菌中已经鉴定出24 种O 血清型。将血清型与数据库菌株构成对比存在差异，结果证明样品来源不同或各血清型分布不同存在着地区差异。

血清分型有助于我们正确识别克罗诺杆菌，虽然其操作存在一定繁琐、耗时等问题，但O-抗原基因簇的多样性一定程度上反映其结构的多样性，对克罗诺杆菌O-抗原基因簇的研究为明确血清学分类与基因之间的关系提供了可靠线索。其结果直观、准确，并且对食源性疾病的治疗有益，因此目前仍然被广泛应用。

2.2 生化分型

生化方法是较早应用于克罗诺杆菌的常规分型方法，主要是依据克罗诺杆菌不同的生理生化反应来进行判定。传统的生化分型主要通过生理生化反应：福格斯-普里斯考尔实验、甲基红反应、吲哚反应、鸟氨酸脱羧酶反应、乳糖产酸反应、D-葡萄糖的产气反应、丙二酸利用等[31]，来确定克罗诺杆菌的生化表型。但目前常用的是比传统生化鉴定方法更准确、更快速的API20E、ID32E 两种生化鉴定系统。API20E 是通过酶促反应及代谢产物检测而研制的被国际公认的细菌标准鉴定系统，也是肠杆菌科的标准鉴定系统[32]。ID32E 鉴定试条由32 个干燥的培养基测定小管组成，通过液体方式进行接种、培养后使用鉴定软件对结果进行判定。LU 等[33]将分离自PIF 及加工环境的75 株克罗诺杆菌进行API20E 生化分型鉴定，共分为8 种生物型。2008 年，李磊[34]对分离自婴儿奶粉的23株野生克罗诺杆菌进行生化分型，经API20E 生化鉴定条将23 株菌分为7 个生化型。2014 年LU 等[33]利用API20E 生化分型系统将来自不同PIF 加工环境的75 株克罗诺杆菌分为8 种生化表型。2020 年，Chen等[35]利用API20E 生化系统对从贵州350 个PIF 样本分离出的21 株克罗诺杆菌进行鉴定，结果共分为6种生化表型。传统生化反应的方法虽应用较早，但其存在耗时长、操作繁琐、不易分辨结果，并且存在一定假阳性等问题，所以并没有微生物自动化检测系统应用广泛。因API20E、ID32E 等生化鉴定方法能更加快速、准确地发现和鉴定病原体等特点，而越来越多地应用于克罗诺杆菌分型领域。

2.3 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分型

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）已成为一种有效的分析工具，用于高效分型鉴定人类病原微生物的新兴技术[36]，它使用来自完整细菌细胞的独特蛋白质或脂质，分析从整个细菌中提取的蛋白质的谱，类似于使用DNA 指纹的DNA 检测方法，生成的数据具有可重复性，可用于在属和种水平上区分细菌种类[37]。LU 等[33]将分离自PIF 及加工环境的75 株克罗诺杆菌进MALDI-TOF MS 蛋白分型鉴定，共分为18 个MAL DITOF MS 型。LU 等[33]利用MALDI-TOF MS 对来自不同PIF 加工环境的75 株克罗诺杆菌进行蛋白分型，可分为36 个MALDI-TOF MS 型。2019 年，刘铭等[38]利用MALDI-TOF MS 技术对分离自水、食品和粪便样品的82 株克罗诺杆菌进行鉴定，将其分为5个群体（MS-1、MS-2、MS-3、MS-4、MS-5），分别与C.sakazakii、C.malonaticus、C.dublinensis、C.turicensis、C.muytjensi 等5 个种对应。2021 年，Sulaiman 等[39]使用MALDI-TOF MS 系统完成对回收自环境的83 株克罗诺杆菌的鉴定，共鉴定出44 株阪崎克罗诺杆菌并且可信度高达99.99 %。

MALDI-TOF MS 虽仪器成本相对较高，但上述研究说明MALDI-TOF MS 具有较高的灵敏度，同时其样品制备简单、自动化程度高、准确高速、具有高通量和高效率等优点[40]，因此MALDI-TOF MS 分型方法在克罗诺杆菌的分型鉴定中已经应用广泛，并取得了非常理想的效果。

3 克罗诺杆菌分子分型技术

3.1 脉冲场凝胶电泳分型

脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)是一种在1984 年开发的溯源分型方法，该技术主要是借助限制性核酸内切酶对菌株DNA 稀有切点进行特异性酶切，产生不同大小的DNA 片段，经脉冲场凝胶电泳分离，形成特异性PFGE 图谱，从而判断菌株的亲缘关系[41]。因此，它成为微生物污染来源追踪的早期工具，是细菌分型中最为传统并且应用广泛的方法之一，且常用于克罗诺杆菌分型的技术[42]。PFGE分型常用的限制性核酸内切酶有2 种[43]，分别是XbaⅠ一级内切酶和Sep Ⅰ二级内切酶，2 种内切酶可单独使用，然而Cui 等[44]在2014 年对几个菌株用Xba I消化时表现出相同的PFGE 模式，但在使用Spe I 时表现出不同的PFGE 模式。因此，2 种限制性内切酶配合使用对克罗诺杆菌进行酶切效果更好。

在Cui 等[44]的研究中，105 个克罗诺杆菌分离株显示出85 种可区分的XbaI-SpeIPFGE 模式。PFGE揭示了基因组DNA 高度的遗传多样性，使用辛普森的多样性指数计算的判别指数为0.9940。然而，当分离物分别用XbaI 和SpeI 消化时，可分别分为83 和86 个PFGE 带型。因此，使用SpeI 的识别率可能高于使用XbaI 的识别率。2018 年，张博等[43]选用4 种内切酶对34 株克罗诺杆菌进行PFGE 分型，其中4 种酶可将34 株菌株分为27 个基因型，而3 种酶结合使用仅能分为21 个基因型，可见选用酶种类越多，分型分辨率越高。2020 年，张彩霞等[45]对分离自婴幼儿配方粉、巧克力等食品中的68 株阪崎克罗诺杆菌进行PFGE分子分型，结果68 株菌株形成58 个PFGE 带型，其中同一带型的菌株来源较集中，说明受同一来源克罗诺杆菌污染的可能性大。2021 年，苏秀敏等[46]从工厂采集的1 246 份样品中分离得到33 株克罗诺杆菌，经PFGE 分型分为14 个PFGE 带型，并结合PFGE 结果明确了员工鞋底、工厂周边土壤、加工车间、净化系统进风口等可能是克罗诺杆菌污染的关键点，达到溯源目的。2021 年，闫军等[47]对分离自2 405 份黑龙江PIF企业加工环节样品的16 株克罗诺杆菌进行PFGE 分型，共分为10 个型别。其中来自同一生产线不同环节的分离菌株带型相同，说明生产过程可能对产品造成污染。2022 年，李毅等[48]对检自296 份食品香辛料和调味品中的66 株克罗诺杆菌进行PFGE 与MLST 分析。经PFGE 分析共分为51 个带型，经MLST 分析共分为25 个ST 型。结果显示具有相同的MLST 型却有不同的PFGE 型，显示出PFGE 比MLST 更强的分辨能力和追踪溯源分析能力。

多个研究可以看出PFGE 具有特异性高、可重复性好、结果高度可信等优点，已成功应用于克罗诺杆菌分型溯源研究。但是PFGE 本身存在一些限制，克罗诺杆菌菌株具有内在的DNA 酶活性[49]，不能对所有菌株进行分型，不同菌株的PFGE 谱图可能相同，且该方法仍不能鉴定菌株，不能给出菌株之间的关系，它不适用于所有克罗诺杆菌株。

3.2 多位点序列分型

多位点序列分析 (multilocus sequence typing,MLST)是基于DNA 的高度灵敏的分型方法，是一种选用7 个看家基因（atpD、fusA、glnS、gltB、gyrB、infB 和ppsA）进行序列分析的基因分型方法，在鉴定和聚类的细菌分离基础上可以用来分析物种的遗传多样性[31]。2015 年，Joseph 等[50]对325 环境拭子样本进行MLST分型，已鉴定出包括克罗诺杆菌属的115 种序列类型（ST）。其中，53 个STs 已被确定为阪崎克罗诺杆菌，与新生儿脑膜炎有关。2018 年，Guo 等[51]使用MLST 重新分析了2005 年至2006 年间从进口PIF 中回收的52 株分离株，这些分离株被确定为阪崎克罗诺杆菌，共有8 个ST 型，包括致病性ST1、ST4 和ST12。2018年，Peng 等[52]在中国东北地区800 份饮用水、冷却新鲜猪肉、PIF、方便面、饼干、水果、蔬菜和准备好的菜肴中分离出34 株克罗诺杆菌。后经MLST 分析，使用根据看家基因设计的引物扩增克罗诺杆菌分离株的DNA 并测序，将34 个分离株分为15 个ST 型，其中ST4 最多占比29.4%。Chen 等[35]同样对从贵州350 个PIF 样本分离出的21 株克罗诺杆菌进行MLST 分析，结果共分为11 种ST，其中，ST193 和ST157 是从市售PIF 中分离出的克罗诺杆菌的显性ST。2021 年，Irshad等[39]利用MLST 数据库分析来自美国12 个地理位置的785 个环境监测样本中回收的83 个克罗诺杆菌分离株时，清楚地揭示了12 个不同的克隆复合物。并基于克罗诺杆菌MLST 数据库的临床菌株的比较分析，显示几乎50 %菌株为临床最常见的ST4，而其余菌株被鉴定为ST8。

虽然设计一个用于克罗诺杆菌MLST 方案需要设计扩增引物和测序等大量前期工作，但其对克罗诺杆菌的分析快速，可重复性强，分辨率较高，所得数据准确。因此，该方法可以在未来的克罗诺杆菌属物种研究中发挥重要作用。因此，MLST 已广泛应用于对PIF 及其生产设施和临床克罗诺杆菌分离株的分析。

3.3 CRISPR-Cas 阵列分析

CRISPR-Cas 系统为细菌提供针对噬菌体和质粒的序列特异性、获得性防御，是细菌的适应性免疫系统[53]。CRISPR 位点用于细菌分型的原理是使用标记的引物PCR 扩增CRISPR 阵列，这些引物可识别定向重复序列，然后将PCR 产物使用正向和反向扩增引物进行测序。CRISPR-Cas 阵列分析是一种非常强大的微生物来源追踪方法，因为它可以区分同一MLST 克隆簇和PFGE 组中的菌株[54]。2017 年，Oodzki等[55]使用CRISPR-Cas 系统对经MLST 确定的2 株都柏林克罗诺杆菌ST80 菌株进行分析，结果显示2株分离株的CRISPR-Cas 型（CT）不同。2018 年，Zeng 等[56]将他们的研究扩展到克罗诺杆菌属，并预测克罗诺杆菌祖先菌株可能同时具有I-E 亚型和I-F CRISPR-Cas 系统，但I-F 亚型选择性退化并被大多数克罗诺杆菌致病菌丢失，且植物相关物种都柏林克罗诺杆菌具有更高的CRISPR 活性，进一步扩展了该方法在克罗诺杆菌分型中的作用。2019 年，Zeng 等[57]利用CRISPR-Cas 对257 株阪崎克罗诺杆菌、丙二酸盐克罗诺杆菌和都柏林克罗诺杆菌进行分析，结果显示161 株阪崎克罗诺杆菌可分为129 种CT；65 株丙二酸盐克罗诺杆菌分为42 个CT 型；31 株都柏林克罗诺杆菌分为31 个CT 型。2020 年，Zeng 等[58]分别对54 株分离自588 份肉类的克罗诺杆菌进行MLST分型以及CRISPR-Cas 阵列分析，结果显示出40 种ST 和60 种CT。这些结果表明，CRISPR 分型结果与MLST 具有良好的对应关系，且与MLST 相比，CRIS PR-Cas 具有更大的区分相似菌株的能力，效果更好，结果也更加直观，可用于克罗诺杆菌更精细的分型。

3.4 随机多态性扩增DNA 基因分型

随机多态性扩增DNA(Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD) 技术采用随机选择的单一引物，通过PCR 即能产生复杂基因组。其是一种操作简单、可行性高、高灵敏度的遗传标记技术，目前广泛应用于微生物的分子分型、物种亲缘关系确定等领域[59]。2012 年，杨海荣等[60]采用RAPD 对8 株克罗诺杆菌标准菌株DNA 进行扩增，并从产物中选取可以将克罗诺杆菌属明确区分的特异性引物，以此对30 株食品克罗诺杆菌分离株进行RAPD 分型。结果38 株可分为37 个不同的RAPD 带型，而按照其遗传差异可以分为8 个基因型类群，可见该技术可用于克罗诺杆菌不同种的鉴定。2013 年，陈万义等[61]对由8 株模式菌株与35 株食品分离菌株组成的43 株克罗诺杆菌属菌株基于gyr B 基因多态性进行聚类分析，结果发现克罗诺杆菌属之间的菌株聚成一类，5 株肠杆菌属菌株聚在一起，并且阪崎克罗诺杆菌也被分成了7 个类群。结果可以看出gyr B 基因适合用于区分克罗诺杆菌属菌株和其他肠杆菌属菌株，以及gyr B 基因在克罗诺杆菌属菌株种水平上的多态性。该方法技术简单，不需要预先知道分离物的基因序列信息，具有普遍适用性，可为食品和环境中克罗诺杆菌的分型和溯源提供参考。

3.5 核糖体分型

核糖体分型通过将细菌分离株进行酶切，并经凝胶电泳将酶切结果显示出来，最后对其图谱进行分析。该方法是一种适用于克罗诺杆菌的快速分子分型方法，基于核糖体分型方法在确定遗传结构、系统发育关系、区别不同来源阪崎克罗诺杆菌等方面非常有效[62]。2010 年，Pei 等[63]采用杜邦RiboprinterTM指纹图谱分析仪对分离自食品的29 株克罗诺杆菌进行核糖体分型，运用BioNumerics 数据库软件建立相应的核糖体指纹图谱数据库进行分析，结果核糖体分型将29 株克罗诺杆菌分离株分成26 种核糖体带型。2016 年，陈万义等[64]以分离自蔬菜的13 株阪崎克罗诺杆菌和乳粉的2 株阪崎克罗诺杆菌为研究对象进行核糖体分型，并利用BioNumeicrus 软件对其结果进行聚类分析，按照相似性大于80 %计算后根据辛普森方程计算该分型方法的分辨率可达到0.808，且乳品分离株和其他实验菌株明显不同，其他分离菌株聚成一列，并显示出高基因相似性，成功将不同来源的菌株区别开来。

以上实验结果表明核糖体分型适用于不同来源的克罗诺杆菌分离菌株之间的鉴定与分型。它能够将不同来源的分离菌株区别开来，尽管该方法费用相对较高，但是其操作简便，结果判断快，重复性相对较高，省时省力，一次可同时对多个样品进行处理。因此，在紧急状况下采用该技术对乳粉及其他食品来源的克罗诺杆菌进行快速分子分型是非常有效的。

3.6 特殊基因分型

除上述提到几种传统的分型方法外，还有一些基于特殊基因的用于克罗诺杆菌分型鉴定的方法，例如基于16S rRNA 的单基因座序列分型(SLST)是用于细菌鉴定和建立系统发育关系最广泛使用的技术。2015年，娄彬彬等[65]利用16S rDNA 基因测序的方法对分离自不同地区乳粉加工环境的37 株克罗诺杆菌进行鉴定，所有菌株（除ES4）与阪崎克罗诺杆菌的同源性最高，相似性达99%，鉴定为阪崎克罗诺杆菌。另外，编码细菌RNA 聚合酶β亚基的rpo B 基因也已用于克罗诺杆菌属的鉴定。2009 年，Stoop 等[66]开发并评估了基于rpo B 的PCR 系统，该系统可以区分克罗诺杆菌属中的6 个物种。2017 年，Miranda 等[67]对分离自44 个国家不同食品的195 份样中的51 个克罗诺杆菌分离株进行rpo B 位点扩增并进行16S rRNA 测序，核苷酸测序揭示了在回收的克罗诺杆菌分离株中相当大的种间和种内遗传变异性。2021 年，Sulaiman 等[39]在使用上述两步PCR 方案时，所有来自各个环境样本的83 个分离株在rpo B 位点均被鉴定为阪崎克罗诺杆菌。然而，基于16S rRNA 的SLST 和基于生物分型的表型分析有一些局限性，且与MLST 相比16S rDNA 的基因序列多样性较低。该方法不可以一次性地将克罗诺杆菌的所有的“种”区分，还需要与其他方法结合才能实现。

3.7 全基因组分型

全基因组测序（whole genome sequencing,WGS）技术能够在基因水平上全面分析其序列组成特征，是从整个基因组的角度分析菌株特性的有效方法，在食源性疾病爆发病原菌的流行病学调查中发挥了重要作用[68]。2018 年，冯婧[69]对分离自PIF 及其加工环境的15 株不同ST 菌株与已完成测序的12 株参考克罗诺杆菌菌株进行比较基因组分析。结果表明，测序菌株可分别归属于阪崎克罗诺杆菌和丙二酸盐克罗诺杆菌2 个种。同时利用Roary 软件通过比较基因组学的泛基因组，并通过COG 数据库对其结果进行分析，发现27 株克罗诺杆菌基因组划分成11 262 个直系同源簇，其中特有基因占总基因簇的43 %，三类基因在26类功能分类中均有富集，表明克罗诺杆菌各项功能是由整体遗传物质统筹调控的。2019 年，WANG 等[70]对2006 至2015 年间输入北京的奶粉中分离的阪崎克罗诺杆菌进行WGS 分析，测得其主要的型别为ST1 和ST4 型。2021 年，Gan 等[10]对从617 份PIF 及其工厂环境样品中分离出的15 株克罗诺杆菌进行WGS 分析，结果15 株分离株均为阪崎克罗诺杆菌，且均分为7个ST 型，其中ST46 为显性。2021 年，张红芝等[71]对婴幼儿食品中分离的阪崎克罗诺杆菌进行WGS 分析，其研究中分离的9 株阪崎克罗诺杆菌共分为5 个ST型，ST1 和ST64 型为显性，分别来自PIF 和婴儿辅食，表明阪崎克罗诺杆菌污染对婴幼儿存在潜在的危险需提高重视。

全基因组测序技术要求高且测序时间较长。但随着WGS 对克罗诺杆菌进行高分辨率跟踪、费用逐步降低、测序时间逐步缩短等优势的显现，该方法逐渐取代传统克罗诺杆菌分型方法，广泛用于克罗诺杆菌的分型及溯源中。

4 总结与展望

对常用于克罗诺杆菌的分型方法进行了概述，其中血清分型结果对克罗诺杆菌血清型的确定有利于临床疾病的溯源与治疗，虽然此类方法存在操作繁琐并且分辨率较低等问题，但目前技术的开发一定程度上弥补了这种不足。生化分析方法作为基于生理生化反应的表型分型方法较其他方法应用较早、方法更成熟、结果更直观，但操作繁琐导致鉴定耗时长。多位点序列分析方法在对目的菌株多态性和菌株间亲缘关系的分辨上更有优势，但该方法分型过程中涉及7 个看家基因，因此成本较高。随着研究的深入以及数据库的不断完善，MALDI TOF MS 作为一种新兴的分型方法可配合其它分型方法实现对食源性致病菌的快速诊断。脉冲场凝胶电泳作为一种以酶切片段为依据的分子分型方法分辨率更高、准确、快速等特点，因此在克罗诺杆菌流行病学分析方面应用很广泛。随着测序技术的发展基于全基因组序列的分型方法表现出对微生物的高分辨力及数据的可共享能力，在食源性致病菌溯源分析及流行病学监控方面有着更加突出的优势。因此全基因组数据的分析与处理成为了溯源分型的关键，这就要求今后具有完备的生物信息学相关软件及标准的分析流程，以更好地发挥全基因组分型技术的优势。

目前克罗诺杆菌造成的婴儿配方乳粉污染已经逐渐呈现出全球化趋势，因此未来对克罗诺杆菌的分型溯源分析一定会趋于标准化、规范化。克罗诺杆菌的分型并不仅仅依赖于一种分型方法，而是多种传统分型方法与新型分型方法的结合应用来达到分型目的，在具有合适分型依据的基础上，选择最佳的分型方法可以帮助我们找到克罗诺杆菌的污染源，达到更好的防控效果。