绒毛白蜡嫩枝扦插生根的解剖学特征与内源激素变化

王因花，燕丽萍，孔雨光，吴德军，任 飞，梁 静

（1. 山东省林业科学研究院 山东省林木遗传育种重点实验室，山东 济南 250014；2. 山东省国土空间规划院，山东 济南 250014）

绒毛白蜡Fraxinusvelutina为木犀科Oleaceae白蜡属Fraxinus植物，落叶乔木，是我国北方重要的用材、防护及园林观赏树种，因其抗逆性强，适应范围广而得到广泛栽培利用。黄河三角洲作为环渤海经济发展的重要组成部分，其土壤盐碱化问题突出，生态环境十分脆弱，亟待开发利用。绒毛白蜡具有优异的耐盐性且寿命长，在盐碱地改良和生态建设中有很好的应用前景。近年来，我国已选育出诸多生长性状良好、观赏性、抗逆性更强的绒毛白蜡优良品种[1-2]，但良种资源的规模化与普及程度低，苗木供应不足，已成为其产业化发展的瓶颈。

绒毛白蜡是从美国引进的雌雄异株物种[3]，种子繁殖不能保留双亲的优良特性，因此需要无性繁殖技术进行良种培育。扦插繁殖因其操作简单，是林木无性品种在林业生产中推广利用的主要繁殖方式。研究表明，绒毛白蜡嫩枝扦插适宜在温湿度可控的温室内进行，经NAA 处理后的嫩枝生根率可达100%[4]；磁化水处理可极大提高绒毛白蜡嫩枝扦插的生根率和根系效果指数[5]；植物生长调节剂处理影响插穗生根率[6]，其中，IBA 和NAA 对白蜡嫩枝扦插生根的促进作用较为显著[7]。

目前，我国白蜡嫩枝扦插技术已取得一定突破，生根率显著提高，但绒毛白蜡良种嫩枝扦插生根机理尚无系统研究。鉴于此，本研究对绒毛白蜡嫩枝扦插过程中的形态解剖特征进行观察，分析内源激素含量变化，探讨绒毛白蜡嫩枝扦插的生根机制，以期为深入研究绒毛白蜡扦插生根机理提供一定的借鉴。

1 材料与方法

1.1 材 料

7 月份，采集绒毛白蜡2 ～3 年生母树上的半木质化穗条，长度为8 ～10 cm。插穗的下切口呈45°斜剪，上切口平剪，每个插穗保留2 片复叶。扦插基质由椰糠、珍珠岩、蛭石按体积比7∶2∶1配制而成。扦插前24 h 将基质浇透水，并用800倍多菌灵溶液消毒。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计

以200 mg·L-1IBA 浸泡20 min 为处理组，清水浸泡为对照组，每个处理50 个插穗，重复5 次。其中2 个重复用于切片制作及激素测定，3 个重复用于生根指标调查。

1.2.2 扦插及插后管理

试验于2021 年7 月份在配有自动喷雾和降温设施的塑料大棚内进行，棚内温度控制在30 ～45 ℃，湿度控制在90%以上。插穗处理完毕后，随即扦插。扦插完成后立即浇透水，并将插孔周围的基质压实。

1.2.3 生根调查

扦插后第40 天，调查生根率、不定根数量及不定根长。

1.2.4 取样及切片制作

以处理组的插穗为样品，扦插当天取样1 次，之后每隔7 d 取样1 次，直至生根为止。截取插穗基部1 cm 处茎段，置于70% FAA 固定液固定24 h 以上。经脱水、包埋后，用石蜡切片机（型号RM2016）切片，切片厚3 μm，番红固绿染色，二甲苯透明5 min，中性树胶封片，Olympus 显微镜观察。

1.2.5 内源激素测定

以处理组和对照组的插穗为样品：扦插后的第0、10、20、30、40 d 随机抽取插穗基部1 cm处的韧皮部1.0 g 左右，重复3 次，用锡纸包好后立即放入液氮中冷冻保存。用ELISA 法进行IAA、ABA、ZR 及GA3含量测定。

1.2.6 数据统计与分析

采用Excel 2016 补充版本进行数据统计和作图，SPSS 23.0 软件进行方差分析与多重比较。

2 结果与分析

2.1 绒毛白蜡扦插生根指标调查

扦插后第40 天对处理组和对照组的生根率、不定根数量及不定根长度进行统计分析，结果见表1。结果表明，对照组的生根率为80.7%，处理组的生根率为96.7%，两者之间差异显著（P＜0.05）；对照组的总根数平均为7.7 条，不定根长度平均为6.2 cm，而处理组的总根数平均为8.2 条，不定根长度平均为7.8 cm，对照组和处理组的总根数、不定根长度之间在统计学上无显著差异。由此可见，外源IBA 显著提高了绒毛白蜡的嫩枝扦插生根率。

表1 对照组和处理组扦插生根指标分析†Table 1 Analysis of cutting rooting indexes of CK and treatment group

2.2 绒毛白蜡扦插生根过程观察

以处理组的插穗为材料，取样过程中同时进行插穗外部形态观察。扦插后第7 天，插穗切口处已有少量白色愈伤组织形成；第14 天，韧皮部与木质部之间被愈伤组织充满；第21 天，愈伤组织继续膨大，尚未观察到不定根生成；第28 天，有少部分插穗在切口处的皮部长出幼嫩的乳白色根系，此后插穗开始陆续生根；第40 天，大部分插穗已生根。经观察，绒毛白蜡为皮部生根类型，具体情况见图1。

图1 绒毛白蜡生根过程Fig. 1 Rooting process of F. velutina

2.3 绒毛白蜡生根解剖结构研究

扦插前绒毛白蜡的茎横切面结构见图2a。由图2a 可以看出，绒毛白蜡的横切面结构由外到内可分为表皮、皮层、韧皮部、形成层、木质部、髓六部分。表皮的最外层为紧密排列的柱状细胞，往内由2 ～3 层长方形细胞排列而成，表皮染色颜色较深。表皮内部是由数层薄壁细胞组成的皮层，皮层细胞形状不规则，排列较疏松；从皮层向内部看，有一圈团状的韧皮纤维，但韧皮纤维不是连续的；韧皮纤维内部依次为韧皮部、维管形成层、木质部和髓。经过多张横面段结构图的观察，在绒毛白蜡茎段中未发现根原基。

图2 绒毛白蜡嫩枝扦插生根过程的解剖结构Fig. 2 Anatomical structure of softwood cutting during rooting process of F. velutina

图3 扦插生根过程中内源激素的变化情况Fig. 3 Changes in endogenous hormones during the rooting process of cuttings

进一步观察绒毛白蜡的生根过程发现，扦插生根可以大致分为根原始细胞的形成和分化、根原基的形成以及不定根的表达3 个阶段。图2a 为扦插前绒毛白蜡茎的横切面结构。扦插第14 天左右，观察到靠近维管形成层的韧皮部薄壁细胞分生形成根原始细胞团（图2b），根原始细胞团不断进行分裂；第21 天左右，形成近三角形的根原基（图2c），根原基朝着皮层方向生长，并从韧皮纤维间隙处到达皮层；第28 天左右，突破种皮形成不定根（图2d）。

扦插后第7 天左右，插穗切口处的韧皮部和木质部之间开始形成愈伤组织，愈伤组织不断生长，直至充满整个切口，但在愈伤组织内并未发现根原基（图2e）。愈伤组织的形成可以保护插穗免受病菌进入，从而降低插穗腐烂率。

2.4 嫩枝扦插生根过程中的内源激素变化情况

图3 为扦插生根过程中内源激素IAA、GA3、ZR 及ABA 的变化情况。由图3a 可以看出，从扦插开始，处理组和对照组的IAA 含量始终处于上升趋势，尤其是在不定根形成期，IAA 含量大幅上升，且处理组的IAA 含量始终高于对照组的IAA 含量，至扦插第40 天，处理组的IAA 含量比扦插前提高了20.3%，对照组的IAA 含量比扦插前提高了11.1%。

图3b 为处理组和对照组的GA3含量变化情况。可以看出，处理组和对照组的GA3含量呈现出相反的变化趋势。自扦插开始至第30 天，处理组的GA3含量逐渐下降，第30 天降至最低，而后逐渐升高；对照组的GA3含量变化趋势则恰好相反，自扦插开始至第30 天，对照组的GA3含量持续升高，第30 天后达到峰值，而后逐渐降低。总体来看，对照组的GA3含量始终高于处理组的GA3含量。

图3c 为处理组和对照组的ZR 含量变化情况。可以看出，处理组的ZR 含量也是以扦插的第30天为分界点，30 天内其ZR 含量逐渐上升，第30天达到峰值，而后逐渐下降；对照组的ZR 含量则一直处于上升状态，前20 天内处理组的ZR 含量高于对照组的ZR 含量，20 天后对照组的ZR 含量则高于处理组的ZR 含量。

图3d 为处理组和对照组的ABA 含量变化情况。可以看出，处理组的ABA含量变化趋势较复杂，呈现出上升—下降—上升的趋势，对照组的ABA含量则是先下降然后持续上升，且处理组的ABA含量始终高于对照组的ABA 含量。

3 讨 论

3.1 外源IBA 对绒毛白蜡嫩枝扦插生根指标的影响

植物生长调节剂在提高扦插生根率方面发挥着重要作用，尤其对于难生根的树种，其效果更为显著[8]。路斌等[9]研究了IBA、IAA、NAA 对金叶白蜡扦插生根率的影响，结果表明3 种生长调节剂都可显著提高金叶白蜡的生根率和生根数，其中以IAA 和IBA 的混合液效果最好，可显著提高插穗体内SOD、POD 及PPO 酶的活性，有利于插穗生根。本研究中，对照组的生根率为80.7%，处理组的生根率为96.7%，两者之间差异显著，说明IBA 的使用显著提高了绒毛白蜡嫩枝扦插的生根率，这与何立在对节白蜡的相关研究中得出的结论相同[7]，但对照组与处理组在不定根数量和不定根长度方面并无统计学上的显著差异。

3.2 绒毛白蜡嫩枝扦插的解剖学研究

植物的茎是扦插材料中应用最广泛的一种，其结构与植物的生根能力密切相关[10-11]，因此，茎的解剖结构、根原基类型及生根类型是扦插解剖学的研究重点[12]。

绒毛白蜡的茎段结构主要包括周皮、皮层、韧皮部、形成层、木质部和髓，其中在皮层与韧皮部之间存在环状的韧皮纤维。有研究认为，韧皮纤维会对根原基的生长形成物理阻碍，进而导致生根困难[13]，但也有人指出，只要该层厚壁组织不是处于连续状态，则较易产生不定根[14-15]。本研究中，绒毛白蜡茎的解剖结构中虽然存在韧皮纤维，但该层纤维组织并不连续，而是和薄壁细胞组织相间排列，从而在一定程度上减少了不定根发生、生长的阻力。

在植物的扦插生根过程中，不定根的起源可分为潜伏根原始体和诱生根原始体[16]。潜伏根原始体是指在植物体内休眠的根原始细胞，当离体植物材料被置于适宜的环境条件下时，潜伏根原始体将恢复分裂能力并逐步发育成为不定根。而诱生根原始体则是指在植物体内本来不存在的根原始细胞，于特定条件下扦插后被诱导形成，例如朝鲜崖柏、草原樱桃、鞑靼忍冬等[17-19]。本研究在绒毛白蜡当年生茎的解剖结构中未发现根原基的存在，而是扦插后才形成根原基，说明绒毛白蜡的生根类型为诱导生根型。

根原基可来源于愈伤组织[20]、髓射线细胞[21]、维管形成层、韧皮薄壁细胞、叶隙薄壁组织细胞等[22]。通过对绒毛白蜡生根过程进行观察，发现其根原基起始于紧邻形成层的韧皮部薄壁细胞，在其他位置尚未观察到根原基的存在。

根据不定根的生长位置可以分为皮部生根、愈伤组织生根以及混合生根等类型。鲁丹等[23]研究发现，红恺木属于混合生根类型，以皮部生根为主，兼有少量愈伤组织生根；周容涛等[24]研究了欧美杂种山杨的不定根发育的解剖结构，认为其属于皮部生根类型。本研究中，绒毛白蜡的切口处虽然形成了较多的愈伤组织，但在愈伤组织内未见根原始细胞，说明绒毛白蜡愈伤组织的形成与不定根的发生是两个相互独立的过程[25-26]，但愈伤组织在一定程度上保护绒毛白蜡的插穗不受病菌感染[27]，降低了插穗腐烂率，对不定根的形成有一定的保护和促进作用。但应注意的是，如果愈伤组织过于发达而过度争取插穗内的营养成分，并不利于不定根的形成。经观察发现，绒毛白蜡的根原基发源于维管形成层附近的韧皮薄壁细胞，为皮部生根类型。

3.3 绒毛白蜡嫩枝扦插生根过程中内源激素变化

不定根的生成是受多种内源激素共同调控的复杂过程。随着植物扦插生根机理的深入研究，人们对生长激素在促进不定根生成中的作用有了更加明确的认识，其中生长素被认为对不定根的生长发育起到核心作用[28]。敖红等[29]研究了内源激素与长白落叶松扦插生根率的关系，发现IAA含量高的插穗具有明显较高的生根率，该研究还指出，IAA 在促进不定根形成的过程中发挥两个重要作用：一是刺激酶系统的活跃，增强呼吸作用和代谢作用，同时促进细胞分化形成愈伤组织；二是使插穗内部的营养物质集中到插穗切口处，从而有利于生根。韩华[30]在分子水平上对杂种落叶松的扦插生根进行了研究，发现能量代谢调控和信号传导调控是调控插穗不定根发生的两个重要方面，并且鉴定出与生长素信号转导有关的两种蛋白。本研究中，处理组和对照组的IAA 含量始终处于上升趋势，尤其是在不定根生长期，IAA含量大幅提高，说明IAA 与绒毛白蜡不定根的形成和生长密切相关，该结果与在菊花、欧洲云杉、珍珠黄杨等植物中的研究结果一致[31-33]。另外，处理组的IAA 含量始终高于对照组，说明外源IBA 的使用可以有效提高插穗体内的IAA 含量，更有利于促进插穗生根。

许多研究表明，细胞分裂素和赤霉素类在植物的扦插生根中起到抑制作用[34-35]，但不能一概定论，不同树种可能存在不同的激素作用机理差异。李朝婵等[36]在对长蕊杜鹃的研究中发现，GA3含量与不定根的形成正相关；李永欣等[37]研究了光皮树扦插生根过程中内源激素的变化情况，认为低浓度的ZR 有利于根原基的分化，高浓度的ZR 有利于根原基生长发育；韩继红等[38]则认为ZR 有利于无患子硬枝扦插的根原基和不定根生成。本研究中，处理组的GA3含量在扦插期的前30 天内持续下降，此阶段正是不定根的形成发育期，说明GA3含量降低有利于绒毛白蜡根原基的生成和发育；30 天后其GA3含量升高，有利于不定根的伸长生长。而对照组的GA3含量变化趋势恰好与处理组相反，说明外源IBA 的使用对插穗体内的GA3变化有一定的影响。处理组的ZR 含量在愈伤组织形成期和根原基形成期上升，在不定根生长期则开始下降，说明高浓度的ZR 有利于绒毛白蜡根原基的形成，低浓度则有利于不定根的生长，这与人们在珍珠黄杨、光皮树中得出的结论较一致[30,35]。通过观察GA3 和ZR 的含量变化，发现外源IBA 的使用可以有效调节插穗内激素含量，使其向促进生根的方向发展。

很多研究认为ABA 对不定根的生成有抑制作用，但在本研究中，处理组的ABA 含量表现出上升—下降—上升的趋势，值得注意的是，处理组的ABA 含量始终高于对照组的ABA 含量，说明在绒毛白蜡扦插苗不定根的生成过程中，ABA 并未起到抑制作用，甚至对不定根的生长有一定的促进作用。杨雪萌等[31]在菊花扦插的研究中也得到了类似的结果，但ABA 的具体作用机制尚待更加深入开展研究。

植物的扦插生根是一个极其复杂的生理过程，除本研究所涉及的解剖结构和内源激素外，其他因素如植物体内氧化酶的活性、可溶性糖、可溶性蛋白、碳氮化合物等营养物质含量及相关基因的表达调控都与根原基的形成密切相关[39]。在后续的研究中，应深入探索影响因子的代谢与调控，以对白蜡生根机理获得更加全面的认识[40]。此外，本研究仅观察到了皮部生根类型，对于白蜡属其他植物是否存在愈伤生根现象以及愈伤生根的机理等问题，也需要进一步深入研究。

4 结 论

绒毛白蜡的生根类型为诱导生根型，根原基发源于维管形成层附近的韧皮薄壁细胞，为皮部生根类型。IAA 与绒毛白蜡不定根的形成和生长密切相关，外源IBA 的使用可以有效调节插穗体内的IAA、GA3和ZR 含量，更有利于促进插穗生根。ABA 对绒毛白蜡的扦插生根没有抑制作用，但其作用机理尚待更加深入开展研究。