两种康复训练方案对组织工程腱-骨界面早期愈合的影响*

潘玮敏，王 兵，刘 民，张明军，王 刚

(1.西安体育学院 运动与健康科学学院,西安 710068;2.西安工业大学 基础学院,西安 710021;3.空军军医大学西京医院骨科,西安 710032;4 体育智能装备关键技术陕西省高校工程研究中心,西安 710068)

前交叉韧带(Anterior Cruciate Ligamen,ACL)断裂后关节镜下采用自体腘绳肌肌腱进行移植重建已成为恢复膝关节稳定性和功能的主要治疗方式,然而单纯移植肌腱在预制骨隧道内的愈合,即腱-骨界面生物愈合则是制约手术成功重要因素[1-2]。由于骨隧道内骨髓基质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSC)的存在,组织工程再生技术被应用于促进二者生物愈合。前期本研究小组应用磷酸钙骨水泥与重组合异种骨粒以适宜比例结合构建了组织工程界面支架CPCXB并将其用于促进ACL重建术后腱-骨界面愈合,结果表明与单独的磷酸钙骨水泥相比,CPCXB可有效促进界面的生物愈合[2]。

然而,实践中术后康复训练决定了年轻患者,尤其是运动爱好者运动功能恢复的程度。现阶段对于ACL重建术后的康复训练方案提倡早期进行给予过激康复训练,避免传统术后保守制动导致并发症的产生。但是,不同学者对于早期术后过激训练方案对于腱-骨界面愈合的影响仍存在争议[3-5],有研究发现自体腘绳肌肌腱重建术后早期过激的康复训练会对尚未愈合的腱-骨界面造成不同程度微动,这种微动有可能导致腱-骨界面愈合延迟,影响ACL术后运动功能的恢复[6-9]。本研究设想通过前期构建的组织工程功能界面CPCBX的介入应用使腱-骨间结合更为紧密,有可能降低康复训练刺激带来的腱-骨微动发生,从而增强组织工程界面愈合的生物学过程,为组织工程界面的进一步应用奠定实验基础。

1 材料和方法

1.1 组织工程界面生物支架CPCXB的构建

磷酸钙骨水泥(Calcium Phosphate Cement,CPC)购自上海瑞邦生物材料有限公司,由固相粉末和液相固化液两部分组成。重组合异种骨粒(Reconstituted Bone Xenograft,RBX)由空军军医大学全军骨科研究所综合骨库提供,主要由经脱脂、脱蛋白的小牛松质骨粒与同源皮质骨中提取的骨形态发生蛋白(Bone Morphological Proteins,BMP)合成。首先将3 mg BMP粉末与直径大小300 μm左右的松质骨骨粒60 mg复合构建RBX。随后将RBX骨粒与CPC固态粉末混合后,装入无菌5 mL注射器中与固化液混合后手动抽吸搅拌均匀后即得糊状可注射生物界面支架CPCBX[6]。

1.2 实验动物ACL重建模型构建

选取23只健康成年雄性新西兰大白兔,体重2.0～2.5 kg,购自空军军医大学实验动物中心。兔双侧ACL重建悬吊固定模型同前[2],实验兔采用846复合麻醉剂肌注麻醉(0.3 ml·kg-1体重)后仰位固定消毒后,双侧膝关节前内侧纵切口分离,将髌骨向外侧脱位切断翼状皱襞,屈曲膝关节完全显露ACL并从两止点完整切除。在股骨外侧髁趾长伸肌肌腱止点处将其截取并剔除肌性部分后作为肌腱移植物,移植物长约3.0～3.5 cm。肌腱两端应用不可吸收缝线编织缝后留长约10 cm作为牵引线。随后建立移植骨隧道:胫骨侧自胫骨隆突向ACL胫骨原止点打一条直径2.5 mm骨隧道,通过该骨道再向上、向外、向后至髁间窝外侧壁后部;靠近股骨原ACL止点向股骨外髁外侧打一条直径相同的骨隧道。移植肌腱用18G针头通过牵引线引导通过胫骨及股骨两隧道,先于股骨隧道外出口缝合、打结、嵌压于股骨隧道皮质外,于屈膝位30°拉紧,然后自关节腔内的两个骨道口注入CPCBX生物支架0.5 ml,再在胫骨侧缝线缝合收紧在胫骨隧道外口打结嵌压于胫骨隧道皮质外,待材料凝固后,逐层关闭切口,消毒。术后实验兔膝关节外不施加固定,自由笼养。

1.3 实验动物术后分组及康复训练策略

依据康复训练刺激方式,术后将实验兔随机分为3组:对照组(CON;n=7),持续被动训练组(CPM;n=8)和CPM+跑台训练组(CPM+TD;n=8)。其中CON组实验期内笼内自由活动,CPM组及CPM+TD组术后第2天分别应用CPM装置及兔子跑台(杭州市段公司,中国)进行康复训练,持续8周,其中CPM装置参照以往研究制作[7](图1)。CPM及跑台训练各项参数参照以往实验制定[8-11]。

图1 兔CPM装置示意图

1.4 Micro-CT检测

训练刺激持续8周后注射过量麻醉药(3%戊巴比妥钠溶液)安乐死处死动物,采集膝关节样本。组织学分析前置于三维Micro-CT扫描仪(Explore-Loce SP,GE,USA)中检测,扫描应用largetube_14um_150min_ss规定条件,选择直径为3 mm的圆形感兴趣区域(ROI)进行三维重建。采用系统自带软件(Microview ABA2.1.2,GE)分析、计算ROI腱-骨界面内矿化组织含量(TMC)、骨体积分数(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数量(Tb.N)和骨小梁分离度(Tb.Sp)。

1.5 组织学分析

样本10%中性福尔马林液固定3天后,梯度酒精(70%,90%,100%)脱水,聚丙烯酸甲酯(polymethyl metacrylate,PMMA)包埋,Lieca SP 1600硬组织切片机垂直方向连续切片(厚度 150～200 μm),研磨抛光至50±10 μm后作Van-Gieson(V-G)染色,随后光学显微镜(DMLA,Leica)下观察分析腱-骨界面处愈合情况。

1.6 生物力学测试

去除8个膝关节样本上所有组织连接,仅保留重建的ACL,使用特殊设计夹具将股骨-移植物-胫骨复合体两端分别固定于AGS型(Shimadzu Corporation,JAPAN)生物力学检测仪两端,以1 N的预载和50 mm·min-1的垂直拉力进行牵拉试验至肌腱从骨隧道中脱出,此时的牵拉力为腱-骨界面所能承受的最大牵拉力(N)。

1.7 统计学处理

采用SPSS21.0进行统计学处理,定量资料采用均数±标准差(±SD)表示。定量数据采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD法。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 实验动物整体情况及康复训练实施

康复训练被广泛用于ACL重建术后的治疗过程,但是其对组织工程腱-骨界面早期愈合的影响却少有报道,因此本研究在实验兔ACL重建术后施加可控且标准化的两种康复训练方案观察其对组织工程腱-骨界面早期愈合的影响(表1)。术后各组实验兔饮食及笼内活动正常,伤口愈合良好,无动物出现异常死亡。所有动物膝关节术后没有半脱位、感染或强直情况发生。依据临床实践ACL术后康复CPM机(Continuous Passive Motion,CPM)的应用,本研究中CPM组使用CPM训练器进行8周的膝关节持续被动训练,训练的速度从持续2周的3°·s-1到后期调整为10°·s-1,而膝关节屈伸活动度从15°到130°之间逐渐增加,每天治疗时间从 10 min递增至120 min。CPM+TD组则首先应用CPM训练器进行4周的膝关节持续被动训练,关节活动范围经评估达到正常后即开始进行4周递增跑速的跑台训练,依据Meng和Pierce等研究将运动强度设置为低强度范围(8～10 m·min-1)[12-16]。参与训练的两组实验兔,尤其是CPM+TD组的实验兔进行跑台训练时,均有实验人员在旁进行监测、辅助及推动鼓励。8周干预结束后,所有实验兔的整体状况良好且膝关节正常。

表1 术后不同训练刺激方案Tab.1 Different training programs after operation

2.2 Micro-CT检测及组织学结果

术后通过Micro-CT检测腱-骨界面新生骨生成及形态结构。实验结果显示各组实验动物膝关节样本界面间反映新生骨生成的TMC量及BV/TV分数值比较差异具有统计学差异(F=4.458,P=0.022;F=6.703,P=0.005),其中CPM+TD组的TMC及BV/TV值则明显低于CON组和CPM组(P<0.05),CPM组TMC及BV/TV值则高于CON组(P>0.05)。术后各组样本腱-骨界面间反映新生骨骨小梁空间形态结构的Tb.Th及Tb.N值比较差异有统计学差异(F=4.458,P=0.022;F=6.703,PV=0.005),其中CPM+TD组的Tb.Th及Tb.N值均明显低于CON组和CPM组(P<0.05),CPM组Tb.Th及Tb.N值均高于CON组(P>0.05)。而Tb.Sp 值各组之间比较差异则无统计学差异(F=1.383,P=0.269),其中CPM+TD组Tb.Sp 值高于其他两组(P>0.05)。见表2。

表2 术后各组腱-骨界面Micro-CT检测结果Tab.2 Results of Micro-CT examination of the tendon-bone interface in each group after operation

术后应用V-G染色观察界面间隙及界面生成物的情况,进一步对Micro-CT影像学数据进行验证。如图2所示,CON组腱-骨界面被新生骨、新生软骨及形状不规则的软骨细胞填充,部分区域仍有CPCBX残存(图2(a));CPM组界面间隙较CON组缩小,界面充满更多新生骨,伴少量CPCBX碎片。界面部分狭窄间隙可发现垂直的胶原纤维(类似Sharpey’s纤维)连接(图2(b));CPM+TD组中界面尽管也被新生骨、新生软骨及材料碎片填充,但界面间隙较CON组及CPM组明显加大,且胶原纤维的方向不一(图2(c))。

图2 术后各组腱-骨界面组织光镜下观察结果(b:骨隧道;if:腱-骨界面;t:移植肌腱;Von-Gieson 染色,光镜 ×100)

尽管ACL术后康复训练方案尚无统一标准,然而研究已证实术后早期启动适宜康复训练所带来的机械应力刺激对于腱-骨界面的早期愈合具有积极作用[17-19]。关节持续被动活动(Continuous Passive Motion,CPM)由于可以缓解疼痛、尽快恢复关节ROM,且有利于移植肌腱再血管化及力学重塑而被广泛应用于ACL重建术后训练。研究发现CPM训练通过膝关节被动屈伸活动产生的移植肌腱与骨隧道壁之间周期性机械应力对ACL 重建术后腱-骨界面愈合有促进作用[10],本研究实验结果进一步证实CPM训练刺激对于组织工程界面的早期生物愈合也具有积极作用。训练8周后CPM组腱-骨界面新生骨量,包括TMC值及BV/TV分数值均高于CON组,同时Tb.Th及Tb.N值也均高于CON组,提示CPM组腱-骨界面新生骨空间结构也优于CON组,这一点组织学结果中也得到验证,不仅界面间隙较CON组缩小,而且界面充满更多新生骨。研究已证实适宜机械应力刺激可增强 BMSC的增殖及分化能力[11],本研究术后施加的CPM训练刺激产生的周期性机械应力一方面可能刺激了骨隧道内BMSC的增殖、分化,另一方面协助了RBX颗粒中BMP的骨诱导作用,进一步促进界面新生骨形成及结构的优化,提高了腱-骨界面的生物愈合。有研究提出CPM产生的周期性适宜机械应力还可帮助骨隧道内更多的BMSC逸出,这一点可能也有助于组织工程界面的再生过程[12]。CPM组虽然组织学结果整体显示优于CON组,但是Mirco-CT测量的各项结果与未施加训练刺激的CON组之间差异却均无统计学意义。分析一方面由于本研究主要关注腱-骨界面的早期愈合,训练刺激仅持续8周导致,其次CON组虽然没有施加可控的术后训练刺激,但是术后实验兔笼内可进行一定的自由活动,自身体重负重活动造成的机械应力刺激可能对于早期组织工程界面生物愈合也有一定的促进作用。但是组织学结果显示,CPM组界面间隙不仅较CON组缩小,而且界面充满更多新生骨,这一点证实适宜的训练刺激对于组织工程界面的愈合更具促进作用。

ACL术后应用过激康复训练模式尽管现阶段仍有一定争议,但是大多研究提出ACL术后CPM的被动关节运动可以通过“泵送效应”协助清除关节腔中的炎性介质,而且帮助关节滑液的分泌,促进营养供应[19-20]。而术后主动跑台训练是通过关节负重运动中载荷产生的机械生物学刺激,进一步促进关节腔内代谢物和营养物质的运输,因而ACL术后非负重的CPM训练结合负重的跑台训练对早期腱-骨界面愈合是有益处的[21-22]。本研究依据以往研究设计对CPM+TD组实验动物术后进行持续4周的CPM训练后,第5周启动了渐进性低强度跑台训练。但是Micro-CT结果显示CPM+TD组的TMC及BV/TV值明显低于CON组和CPM组,而且反映新生骨骨小梁空间形态结构的Tb.Th及Tb.N值均明显低于CON组和CPM组,而骨小梁分离度Tb.Sp 值虽然与其他两组之间比较差异无统计学差异,但其值高于其他两组,提示CPM+TD组界面新生骨量及结构均劣于CON组及CPM组。而组织学结果发现CPM+TD组界面不仅界面间隙较大,而且新生骨也少于其他两组,且胶原纤维较为杂乱,提示CPM+TD组腱-骨界面的愈合相较CON组及CPM组均呈现一定的延迟。ACL重建术中单纯肌腱移植物是以悬吊方式固定于骨隧道出口两侧,且未在ACL本身止点位置,易导致腱-骨界面微动的产生,影响界面愈合。前期我们应用生物支架CPCBX构建组织工程腱-骨界面,术后结果显示其不仅可增强移植肌腱与骨隧道之间初始生物力学强度,最重要的是作为干细胞黏附载体及其内含生长因子可更有效促进界面新生骨形成,有利于界面的早期生物愈合[2]。在此基础上我们设想CPCBX可协助减少初始康复训练刺激产生的微动,促进界面的愈合。然而影像学及组织学结果均提示过早的主动运动介入对于组织工程界面的生物愈合有一定负性作用,分析与过早主动运动介入仍可能增加早期腱-骨界面微动,提高破骨细胞活性,降低界面骨小梁的厚度,不利于界面早期愈合[13-14],因此组织工程界面的运动康复计划制定仍需进一步研究探索。

2.3 生物力学分析

术后各组膝关节样本腱-界面间最大牵拉力比较差异(见表3)具有统计学差异(F=4.850,P=0.019),其中CPM+TD组最大牵拉力明显低于CON组及CPM组(P<0.05),CPM组最大牵拉力则高于CON组(P>0.05)。

表3 术后各组腱-骨界面最大牵拉力

既往研究表明骨形态结构的变化与界面愈合质量呈正相关,而生物力学评估则被认为是界面愈合的重要指标[15]。本实验应用生物力学测试中的最大牵拉力检测移植肌腱与骨隧道之间的愈合,可以更客观的观察腱-骨界面的愈合,直接反映腱-骨愈合过程。前期我们的实验结果证实CPCBX构建组织工程腱-骨界面术后6-8周的最大牵拉力均明显高于空白对照组,提示CPCBX构建的组织工程界面可明显促进腱-骨间的愈合。本研究最大牵拉力测试结果发现CPM+TD组最大牵拉力明显低于CON组及CPM组,而CPM组最大牵拉负荷虽然高于CON组,但两组之间未显示统计学差异,这与Micro-CT骨量、骨结构指标以及组织学的变化一致,最大牵拉力的增加意味着界面更多的骨生长,移植肌腱与骨隧道之间具有更好的愈合,说明CPM训练促进界面早期愈合的效果优于CON组与CPM+TD训练,进一步证实术后不进行康复训练和过早的主动运动均不利于腱-骨组织工程界面的愈合,尤其是过早主动运动介入训练策略可能导致组织工程界面愈合不良。

3 结 论

通过持续8周的两种康复训练方案,ACL术后组织工程腱-骨界面呈现不同的愈合效果。与不进行康复训练相比,渐进CPM康复训练可明显增加腱-骨界面间的矿化组织含量和骨体积分数,骨小梁形态结构的Tb.Th及Tb.N值也有增高。而与渐进CPM康复训练相比,4周CPM联合4周低负荷跑台康复训练后组织工程腱-骨界面的矿化组织含量、骨体积分数以及Tb.Th及Tb.N值明显降低,而且骨小梁分离度Tb.Sp 值则明显增高。组织学结果则发现渐进CPM康复训练后组织工程腱-骨界面间隙明显小于其他康复形式,而且腱-骨界面充满更多新生骨。生物力学结果进一步验证了渐进CPM康复训练后组织工程腱-骨界面最大牵拉力明显高于其他两组,提示渐进CPM康复训练可有效促进界面的早期生物愈合,而术后不进行康复训练和过早的主动运动均不利于腱-骨组织工程界面的愈合,尤其是过早主动运动介入康复训练策略可能导致组织工程界面愈合不良。虽然本研究使用的实验兔康复训练模型并不完全适用于人类,而且仅对组织工程界面早期愈合进行了观察,长期影响还有待进一步研究,但是通过两种康复训练对已构建的组织工程腱-骨界面的早期愈合影响进行的观察,进一步为组织工程功能界面在临床的应用提供了理论依据。