葛根素调控miR-30b-5p表达抑制类固醇诱导的兔股骨头坏死

马曼华 王珊 孟东方

1. 商丘医学高等专科学校临床医学院康复教研室,河南 商丘 476005 2. 河南中医药大学第一附属医院骨科,河南 郑州 450003

类固醇诱导的股骨头坏死(osteonecrosis of the femoral head,ONFH)是一种慢性进行性股骨头疾病,主要由长期过量糖皮质激素诱发,可引起髋关节损伤和功能障碍,最终影响患者生活质量[1]。目前治疗ONFH常用的药物有双膦酸盐、他汀类药物和抗凝血剂,这些药物通过不同的药理机制可以部分恢复骨细胞的功能,但其却存在明显的副作用如胃肠道刺激、肾毒性或下颌关节坏死等[2]。因此,开发一种效果显著、不良反应少的抗ONFH药物至关重要。葛根素是葛根中主要的异黄酮成分之一,具有抗骨质疏松、抗氧化等活性[3]。已有研究报道,葛根素通过促进坏死部位新骨生成,对激素性股骨头坏死模型大鼠发挥治疗作用,但具体机制尚不完全明确[4]。相关研究显示,葛根素通过上调miR-34a促进类固醇诱导的股骨头坏死兔的成骨作用;抑制miR-30b-5p表达可促进类固醇诱导的股骨头坏死的软骨细胞凋亡[5-6]。但葛根素能否通过调控miR-30b-5p表达改善类固醇诱导的ONFH尚不明确。因此,本研究主要探究葛根素对类固醇诱导的ONFH兔氧化应激及细胞凋亡的影响以及可能的分子机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物:84只3月龄体质量为2.25～2.5 kg的新西兰大白兔购自广东双林生物制药有限公司,生产许可证号SCXK(粤)2023-0003。

1.1.2主要试剂:葛根素购自上海同田生物技术有限公司;大肠杆菌内毒素购自上海烜雅生物科技有限公司;甲泼尼龙琥珀酸钠注射液购自国药集团容生制药有限公司;仙灵骨葆胶囊购自贵州同济堂制药有限公司;miR-30b-5p拮抗剂(antagomir)及其阴性对照antagomir NC 购自百奥迈科生物技术有限公司;兔超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)ELISA试剂盒购自上海仁捷生物科技有限公司;鼠源一抗Dickkopf-1(DKK-1)、GAPDH及辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠二抗均购自英国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1ONFH兔模型的构建:ONFH模型的构建[7]:向兔耳缘静脉注射两次大肠杆菌内毒素(10 μg/kg),两次间隔时间为24 h,末次注射内毒素后,立刻通过臀肌注射三次甲泼尼龙琥珀酸钠注射液(25 mg/kg),三次间隔时间为24 h。

1.2.2动物分组及处理:按照随机数字表法将84只新西兰大白兔分为对照组、ONFH组、葛根素低剂量组、葛根素高剂量组、阳性对照组、葛根素高剂量+antagomir NC组、葛根素高剂量+miR-30b-5p antagomir组,每组12只。对照组以生理盐水代替大肠杆菌内毒素、甲泼尼龙琥珀酸钠注射液,其余操作同造模过程;其余各组均需采用大肠杆菌内毒素联合甲泼尼龙琥珀酸钠的方式构建ONFH模型。若Micro-CT结果显示,兔股骨骨小梁数量、骨小梁厚度降低,骨小梁分离度升高,且HE染色显示兔骨小梁排列稀疏、无序、变薄、部分断裂,骨小梁内的骨细胞数量减少,空骨陷窝数增多,则表明模型构建成功,然后进行给药处理。葛根素低剂量组、葛根素高剂量组[5]、阳性对照组[7]分别予以灌胃0.125 g/kg葛根素、0.5 g/kg葛根素、0.4 g/kg仙灵骨葆胶囊,且均需尾静脉注射等量的生理盐水;葛根素高剂量+antagomir NC组灌胃0.5 g/kg葛根素且还需尾静脉注射93.46 μg/只antagomir NC;葛根素高剂量+miR-30b-5p antagomir组[8]灌胃0.5 g/kg葛根素且还需尾静脉注射93.46 μg/只miR-30b-5p antagomir;对照组、ONFH组灌胃等量的生理盐水且还需尾静脉注射等体积的生理盐水。给药一天一次,持续12周。

1.2.3标本收集:末次处理24 h后,处死大白兔,收集大白兔的股骨头,分为两部分,一部分固定于4 %多聚甲醛中用于Micro-CT扫描、HE染色及TUNEL染色,另一部分冻存于-80 ℃冰箱中用于ELISA、qRT-PCR、Western Blot检测。

1.2.4Micro-CT检测:利用Micro-CT扫描固定于4 %多聚甲醛溶液中48 h的股骨头,并分析骨计量学参数骨小梁数量、骨小梁厚度及骨小梁分离度。

1.2.5HE染色检测兔股骨头组织病理变化:取1.2.3中的股骨头,在10 % EDTA中脱钙,并包埋在石蜡中。然后将组织切成5 μm厚的切片。用HE对连续切片进行染色,使用光学显微镜记录组织病理学变化,Image-Pro Plus 6.0软件分析切片上的空骨陷窝数、总骨陷窝数,并计算空骨陷窝率,空骨陷窝率(%)=(空骨陷窝数/骨陷窝数×100 %)。

1.2.6ELISA法检测兔股骨头组织中SOD活性及MDA含量:严格按照试剂盒说明书检测兔股骨头组织中SOD活性及MDA含量。

1.2.7TUNEL染色检测兔股骨头组织中细胞凋亡:取1.2.5中的股骨头组织切片,根据TUNEL试剂盒说明书步骤检测细胞凋亡,凋亡细胞呈绿色荧光,正常细胞的细胞核被染成蓝色。细胞凋亡率(%)=(凋亡细胞数/总细胞数)×100 %。

1.2.8qRT-PCR检测股骨头组织中miR-30b-5p表达:利用TRIzol试剂提取股骨头组织匀浆总RNA。将RNA逆转录为cDNA后,以cDNA为模板进行荧光定量PCR反应。以U6为内参,通过2-ΔΔCt法计算miR-30b-5p相对表达量。引物序列:U6-F:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,R:5′-AACGCTTCACGA ATTTGCGT-3′;miR-30b-5p-F: 5′-CCGAAACATCCT ACACTCAGCTAA-3′,R:5′-CAGTGCGTGTCGTGG AGT-3′。

1.2.9Western Blot检测股骨头组织中DKK-1蛋白表达:利用RIPA裂解缓冲液提取股骨头组织匀浆总蛋白,将50 μg总蛋白经电泳、转膜、封闭后,在4 ℃下将膜与一抗DKK-1、GAPDH孵育过夜,再将膜与二抗共同孵育1.5 h。加入ECL试剂观察蛋白印迹,利用Image J软件评估目的蛋白灰度值。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 葛根素对各组兔股骨头区骨小梁数量、骨小梁厚度及骨小梁分离度的影响

与对照组比较,ONFH组骨小梁数量、骨小梁厚度降低,骨小梁分离度升高(P<0.05);与ONFH组比较,葛根素低、高剂量组、阳性对照组骨小梁数量、骨小梁厚度升高,骨小梁分离度降低(P<0.05);与葛根素高剂量组、葛根素高剂量+antagomir NC组比较,葛根素高剂量+miR-30b-5p antagomir组骨小梁数量、骨小梁厚度降低,骨小梁分离度升高(P<0.05),见图1和表1。

表1 各组兔股骨区骨小梁数量、骨小梁厚度及骨小梁分离度变化比较Table 1 Comparison of changes in the number, thickness, and separation of bone trabeculae in the femoral region of rabbits in each group n=6)

图1 Micro-CT扫描检测兔股骨微结构Fig.1 Micro-CT scan to detect the microstructure of rabbit femur

2.2 葛根素对各组兔股骨头组织病理变化的影响

对照组兔股骨头组织无明显异常,骨小梁整齐致密,排列规则,骨小梁内的骨细胞分布清晰均匀,骨陷窝丰富;ONFH组兔骨小梁排列稀疏、无序、变薄、部分断裂,骨小梁内的骨细胞数量减少,空骨陷窝数增多;与对照组比较,ONFH组空骨陷窝率升高(P<0.05);与ONFH组比较,葛根素低、高剂量组、阳性对照组空骨陷窝率降低(P<0.05);与葛根素高剂量组、葛根素高剂量+antagomir NC组比较,葛根素高剂量+miR-30b-5p antagomir组空骨陷窝率升高(P<0.05),见图2和表2。

表2 各组兔空骨陷窝率变化比较Table 2 Comparison of changes in empty bone lacuna rate among different groups of rabbits n=6)

图2 HE染色检测兔股骨头组织病理变化(200×)Fig.2 HE staining detection of pathological changes in rabbit femoral head tissue (200×)

2.3 葛根素对各组兔股骨头组织中SOD活性及MDA含量的影响

与对照组比较,ONFH组SOD活性降低,MDA含量升高(P<0.05);与ONFH组比较,葛根素低、高剂量组、阳性对照组SOD活性升高,MDA含量降低(P<0.05);与葛根素高剂量组、葛根素高剂量+antagomir NC组比较,葛根素高剂量+miR-30b-5p antagomir组SOD活性降低,MDA含量升高(P<0.05),见表3。

表3 各组兔股骨头组织中SOD活性及MDA含量变化比较Table 3 Comparison of changes in SOD activity and MDA content in femoral head tissue of rabbits in each group n=6)

2.4 葛根素对各组兔股骨头组织中细胞凋亡的影响

与对照组比较,ONFH组兔股骨头组织中细胞凋亡率升高(P<0.05);与ONFH组比较,葛根素低、高剂量组、阳性对照组兔股骨头组织中细胞凋亡率降低(P<0.05);与葛根素高剂量组、葛根素高剂量+antagomir NC组比较,葛根素高剂量+miR-30b-5p antagomir组兔股骨头组织中细胞凋亡率升高(P<0.05),见图3和表4。

表4 各组兔股骨头组织中细胞凋亡率变化比较Table 4 Comparison of changes in cell apoptosis rate in femoral head tissue of rabbits in each group n=6)

图3 TUNEL染色检测兔股骨头组织中骨细胞凋亡(400×)Fig.3 TUNEL staining for detecting osteocyte apoptosis in rabbit femoral head tissue (400×)

2.5 葛根素对各组兔股骨头组织中miR-30b-5p表达及DKK-1蛋白表达的影响

与对照组比较,ONFH组miR-30b-5p表达降低,DKK-1蛋白表达升高(P<0.05);与ONFH组比较,葛根素低、高剂量组、阳性对照组miR-30b-5p表达升高,DKK-1蛋白表达降低(P<0.05);与葛根素高剂量组、葛根素高剂量+antagomir NC组比较,葛根素高剂量+miR-30b-5p antagomir组miR-30b-5p表达降低,DKK-1蛋白表达升高(P<0.05),见图4和表5。

表5 各组兔股骨头组织中miR-30b-5p表达及DKK-1蛋白表达变化比较Table 5 Comparison of changes in miR-30b-5p expression and DKK-1 protein expression in femoral head tissues of rabbits in each group n=6)

图4 Western Blot检测兔股骨头组织中DKK-1蛋白Fig.4 Western Blot detection of DKK-1 protein in rabbit femoral head tissue注:A:对照组;B:ONFH组;C:葛根素低剂量组;D:葛根素高剂量组;E:阳性对照组;F:葛根素高剂量+antagomir NC组;G:葛根素高剂量+miR-30b-5p antagomir组。

3 讨论

ONFH是一种常见且迅速致残的疾病,大多数患者会在2～3年内出现股骨头塌陷,最终出现髋关节功能障碍,给患者家庭和整个社会带来不可估量的劳动和经济损失[9]。Micro-CT是可通过全面、立体的方式测量骨微结构、评价骨质量及预测骨强度的新型技术[7]。本研究利用该技术检测了ONFH兔模型的骨计量学参数,结果显示,与对照组比较,ONFH组骨小梁数量、骨小梁厚度降低,骨小梁分离度升高,表明ONFH兔模型的骨计量学参数异常。据报道,氧化应激与类固醇诱导的ONFH过程密切相关,在激素诱导的ONFH兔股骨头组织中SOD活性降低,MDA含量升高[10]。此外,骨细胞凋亡与ONFH的发生和进展密切相关,当ONFH发生时,股骨头的内部血液供应被切断,导致骨细胞营养不足进而诱导细胞凋亡,骨小梁组织也被慢慢拉松,最终引起股骨头塌陷[11]。本研究显示,与对照组比较,ONFH组兔股骨头组织中SOD活性降低,MDA含量、骨细胞凋亡率及凋亡相关蛋白DKK-1蛋白表达升高,股骨头组织病理损伤严重,表明ONFH兔存在氧化应激及骨细胞凋亡的现象。因此,抑制氧化应激及骨细胞凋亡可能是治疗ONFH的潜在有效策略之一。

葛根素是一种具有高健康价值的天然物质,具有抗氧化、抗炎、提高免疫力、保护心脑血管和骨修复等一系列生物活性[12]。相关研究显示,葛根素对于激素性ONFH大鼠的坏死股骨具有良好的修复作用[13];葛根素可减弱骨间充质干细胞凋亡进而改善糖皮质激素诱导的大鼠ONFH[14]。本研究亦显示,葛根素可抑制ONFH兔股骨头组织氧化应激及细胞凋亡,且葛根素剂量越高,抑制作用越明显。本研究同先前的研究[13-14]一致,证实了葛根素对ONFH具有保护作用,但也对该结论进行了完善,即葛根素对ONFH的保护作用是通过抑制氧化应激及细胞凋亡实现的。另有研究显示,仙灵骨葆胶囊作为临床上常用于治疗ONFH的药物,本研究设置该药物为阳性药物,结果显示,仙灵骨葆胶囊与高剂量葛根素对ONFH兔股骨头组织氧化应激及细胞凋亡的抑制作用差异无统计学意义。提示葛根素可能成为治疗ONFH的潜在有效药物。

近年来,越来越多的研究表明葛根素通过调控miRNA的表达来影响各种疾病的进展。如葛根素通过下调miR-196a-3p促进大鼠成骨细胞增殖和分化,进而改善骨质疏松[15];葛根素通过抑制miRNA-140-5p表达来预防糖尿病肾损伤[16]。且有研究表明在ONFH动物模型中miR-30b-5p表达降低[6]。但葛根素能否通过调控miR-30b-5p表达影响ONFH兔股骨头组织氧化应激及细胞凋亡的研究鲜有报道。此外,有研究显示,miR-30b-5p可通过抑制氧化应激减轻大鼠子痫前期症状[17]。本研究显示,葛根素可促进ONFH兔股骨头组织中miR-30b-5p表达,且葛根素剂量越高,促进作用越明显,推测葛根素可能通过上调miR-30b-5p表达来抑制ONFH兔氧化应激及细胞凋亡。为了验证该推测,本研究在高剂量葛根素作用的基础上再加上miR-30b-5p antagomir来干预ONFH兔,结果显示,miR-30b-5p antagomir减弱了高剂量葛根素对ONFH兔氧化应激及细胞凋亡的抑制作用。证实了猜想的正确性。

综上所述,葛根素可能通过上调miR-30b-5p表达来抑制ONFH兔氧化应激及细胞凋亡。葛根素抑制ONFH兔氧化应激及细胞凋亡的具体机制有待进一步深入探究。