二苯乙烯苷调控PI3K/AKT 信号通路干预SH-SY5Y 细胞凋亡的机制研究

康碧倩，李 悦，何晓璇，肖 振，胡 睿，罗陈亮，乔明宇，吴桂有，李振中，朱晓莹，黄忠仕

（1.右江民族医学院基础医学院，广西 百色 533000；2.广西中医药大学药学院，广西 南宁 530200；3.右江民族医学院药学院，广西 百色 533000；4.右江民族医学院临床医学院，广西 百色 533000）

神经元丢失是多种退行性疾病的发病原因之一。阿尔茨海默症（alzheimer's disease， AD）作为一种常见的神经退行性疾病，是老年人群中仅次于心脏病、恶性肿瘤和中风的第四位死亡原因［1］。目前AD 发病机制尚未明确，但被证实有两种共同的标志性病理变化：β 淀粉样蛋白斑块沉积和高磷酸化Tau 神经纤维缠结［2］，二者都会引起进行性神经元丢失。

研究表明，磷酸肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号通路在细胞增殖分化和生长调节中起着关键作用［3］。已发现此通路参与AD 中两种特殊病理结构的形成［4］，可以调节线粒体膜通透性蛋白Bcl-2、Bax 等表达［5］，因此激活PI3K/AKT 信号通路可能通过保护神经元免受Aβ 诱导的神经毒性，减少神经元丢失，从而延缓AD 发病进展。

神经退行性疾病通常与细胞凋亡过度有关［6］。Bcl-2 蛋白家族严格调节线粒体细胞凋亡。抗凋亡蛋白（如Bcl-xl，Bcl-2 等）通过稳定线粒体膜的通透性和阻止线粒体细胞色素C 的释放而发挥抗凋亡作用，促凋亡蛋白（如Bak、Bax 等）使线粒体外膜通透化，促进线粒体释放细胞色素C 和其他凋亡因子，以触发细胞蛋白酶和半胱天冬酶的活化，使细胞凋亡［7］。抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的平衡决定细胞的存活与否［8］，二者比例可以通过许多信号通路改变，从而有效传递细胞应激信息。

中药何首乌（polygonum multiflorum thunb）具有预防及治疗神经系统病变、提高记忆力的功效［9］，常作为治疗AD 的中药复方或专方使用，而二苯乙烯苷作为何首乌的一种有效成分，是何首乌发挥药效的主要基础［9］。近年来，国内外学者发现二苯乙烯苷（2，3，5，4'-tetrahydroxy stilbene 2-Ο-β-D -glucoside， TSG）神经保护效果良好，本课题组前期研究发现二苯乙烯苷具有较好的抗痴呆作用，能减少Aβ的表达并保护Aβ 代谢产物的神经毒性损伤［10-12］。在此基础上，本实验旨在探讨TSG 通过干预PI3K/AKT 信号通路调控SH-SY5Y 细胞凋亡的具体靶点及作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y 购自武汉普诺赛生命科技有限公司。 二苯乙烯苷（批号：CHB180810）购自成都克洛玛生物科技有限公司；DMEM-F12 基础培养基、0.25%胰蛋白酶、双抗均购于美国 Gibco 公司；胎牛血清（ 批号：1943609-65-1）购自美国Sigma 公司；LY294002（批号：GC15485）、CCK-8 试剂（批号：GK10001）购自上海宏叶生物科技有限公司；冈田酸（批号：AO1IS211161）购自上海源叶生物科技有限公司；TUNEL 细胞凋亡试剂盒（编号：C1806）购自碧云天生物技术公司；ECL 发光底物检测试剂盒（批号：HR20230328M）购自荷瑞生物；山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（批号：SA00001-2）购自武汉三鹰，兔抗AKT 购自abclonal，兔抗PI3K、P-PI3K、AKT、P-AKT、Bcl-2、Bax 均购于Affinity。细胞培养箱购自美国Thermo，荧光倒置显微镜购自Leica，荧光定量PCR 仪购自杭州博日，凝胶电泳仪购自北京六一科技。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与传代 在DMEM-F12 基础培养基中加入15%胎牛血清、1%青链霉素混合液配置成完全培养基，将含完全培养基的细胞置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养，每12～24 h 观察细胞及培养基状态，并及时换液。观察细胞生长至细胞培养瓶底部80%～90%且生长状态良好，1×PBS 清洗三次后用1 mL 0.25%胰蛋白酶反复均匀吹打使之成为细胞悬液，待细胞在显微镜下呈单一、均匀形态时终止消化，换上现配的新鲜完全培养基，均匀分至新的2～3 个培养瓶后放入恒温培养箱，使细胞继续生长。

1.2.2 筛选出最适宜OA 浓度 待细胞生长至80%～90%且生长状态良好时，弃去原有完全培养基，将消化后的细胞按每孔5×104个接种于96 孔板中，待细胞贴壁生长至80%左右，按实验设置分别加入OA 终浓度为0、10、20、40、80、160 nmol/L 的完全培养基，每组设置5 个复孔，96 孔板最外圈空白孔内每孔加入100 μL 完全培养基，置入恒温培养箱内继续培养24 h，然后每孔加入10 μL CCK-8 试剂，37 ℃培养箱培育1 h 后用酶标仪测定每孔在450 nm处的吸光度（OD 值），并计算生存率。生存率=（实验组-空白组）/（对照组-空白组）×100%

1.2.3 细胞分组及处理 取对数生长期、生长状态良好的细胞，分为对照组、模型组、TSG 组、PI3K 抑制剂LY294002 组和LY294002+TSG 组。对照组采用完全培养液培养24 h，模型组、TSG 组加入含OA（40 nmol/L）的完全培养基培养24 h 后，TSG 组再加入以完全培养基配置的100 μmol/L TSG 溶液24 h（此浓度及作用时间根据本课题组前期预实验结果确定）；在模型组给药的基础上，LY294002 组和LY294002+TSG 组用含LY294002（20 μmol/L）的完全培养基预处理6 h 后，LY294002+TSG 组再加入含TSG（100 μmol/L）的完全培养基继续培养24 h。

1.2.4 CCK-8 法检测各组细胞存活情况 按1.2.3中方法处理各组细胞，接种于96 孔板，每组设5 个复孔，密度为5×104/孔，培养24 h后每孔加入10 μL CCK8 试剂，37 ℃培养箱培育1 h 后用酶标仪测定每孔在450 nm 处的吸光度（OD 值），并计算生存率。生存率=（实验组-空白组）/（对照组-空白组）×100%

1.2.5 TUNEL 法检测各组细胞凋亡情况 按1.2.3 中方法处理各组细胞，PBS 洗涤一次后，用4%多聚甲醛固定细胞30 min，再用含0.3% Triton X-100 的PBS 室温孵育5 min，按照细胞凋亡检测试剂盒说明书配置TUNEL 检测液，在样品中加50 μL TUNEL 检测液，37 ℃避光孵育60 min，随后加入DAPI 避光孵育5 min，用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下随机视野观察。用Imagy J 软件分别对TUNEL 阳性细胞（凋亡细胞）和 DAPI 标记的细胞（细胞总数）计数，细胞凋亡率＝TUNEL 阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.2.6 Western Blot 检 测P-PI3K/PI3K、P-AKT/AKT、Bcl-2/Bax 蛋白表达情况 按1.2.3 中方法处理各组细胞，收集细胞，用预冷的PBS 清洗3 次后，加入裂解液（RIPA：蛋白酶抑制剂：蛋白磷酸酶抑制剂=100∶1∶1）于冰上裂解30 min，收集裂解液并于12 000 rpm 离心5 min 后取上清液，采用BCA 法蛋白定量，用酶标仪测562 nm 波长条件下的吸光值，做出标准曲线。对制备好的蛋白样品采用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）进行蛋白电泳，电泳前30 min 采用80 V 电压，电泳至分离胶后采用120 V 电压，将“三明治转膜结构”放入转膜槽中，加入转膜缓冲液，放入冰浴中，300 mA 恒流转膜1 h 后，切断电源。室温下5%脱脂奶粉封闭1 h，加入PI3K（1∶1 000）、P-PI3K（1∶500）、AKT（1∶1 000）、P-AKT（1∶500）、Bcl-2、Bax（均为1∶500）等一抗4 ℃过夜，TBST 洗膜三次，每次10 min，二抗（1∶5 000）室温孵育1 h，TBST 洗膜三次，每次10 min，最后将洗好的膜放入ECL 发光试剂中浸泡润湿后，避光显影。结果用Image J 分析蛋白条带灰度值，用P-PI3K/PI3K、P-AKT/AKT、Bcl-2/Bax 灰度比值表示，并对各组进行归一化。

1.2.7 实时荧光定量聚合酶链式反应法（qRT-PCR）检测PI3K、AKT、Bcl-2、Bax mRNA 表达情况 收集细胞，提取RNA，并用紫外分光光度计测定OD 260/280 值，介于1.8～2.0 表明样本提取的RNA 浓度较高，可以进行后续逆转录实验。按照cDNA 逆转录试剂盒说明指示，配置20 μL 反应体系，反应条件为：25 ℃孵育10 min 后，42 ℃孵育15 min，85 ℃加热5 s，将RNA 逆转录为cDNA。继续配置qRT-PCR 反应体系，95 ℃预变性600 s，95 ℃变性5 s， 60 ℃退火延伸20 s，扩增40 个循环。各目的基因相对表达量的结果均以GAPDH 为内参基因，目的基因的CT 值以2-△△CT法计算。具体引物序列见表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

1.3 统计学处理

采用GraphPad Prism 8.0.2 软件对实验数据进行分析，结果以（±s）表示，两组组间均数比较采用完全随机设计资料t检验，组间均数比较采用单因素方差分析，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度OA 对细胞存活率的影响

实验表明，SH-SY5Y 细胞经0、10、20、40、80、160 nmol/L 浓度梯度的OA 处理24 h 后，随着OA浓度的增高，细胞存活率呈逐渐下降趋势。与对照组比较，40、80、160 nmol/L OA 浓度组细胞存活率均有统计学意义（t=3.022，P＜0.05；t=13.041，P＜0.01；t=15.176，P＜0.01）。当OA 浓度小于或等于40 nmol/L 时，细胞存活率在80%以上，为尽量保证后续实验细胞状态，本实验决定采取40 nmol/L 作为最终OA 加药浓度。见图1。

2.2 二苯乙烯苷对细胞增殖能力的影响

图1 不同浓度OA 对细胞存活率影响Fig 1 Effect of different concentrations of OA on cell viability

将各组细胞按上述1.2.3 分组进行药物干预后，与对照组相比，模型组细胞活力显著下降（P＜0.01），与模型组相比，TSG 组细胞活力得到有效缓解（P＜0.05），LY294002 组细胞活力显著降低（P＜0.01）；而LY294002+TSG 组 比 起LY294002 组 细胞活力得到显著改善（P＜0.05）。见图2。

图2 各组细胞存活率情况Fig 2 Cell survival in each group

2.3 二苯乙烯苷对各组细胞凋亡率检测

按照TUNEL 试剂盒操作，DAPI 组表示显微镜视野下各组细胞染上蓝色荧光，而凋亡的细胞将会染上绿色荧光，即TUNEL 阳性细胞，Merge 后凋亡细胞与未凋亡细胞处在同一视野下方便进行观察。结果表明，与对照组相比，模型组TUNEL 阳性染色细胞数与细胞凋亡率显著增加（P＜0.01）；与模型组相比，TSG 组TUNEL 阳性染色细胞数与细胞凋亡率显著降低（P＜0.05），LY294002 组TUNEL阳性染色细胞数与细胞凋亡率显著增加（P＜0.05）；而加入TSG 后，LY294002+TSG 组相比LY294002组TUNEL 阳性染色细胞数与细胞凋亡率显著降低 （P＜0.05）。见图3、表2。

图3 各组细胞凋亡率情况（TUNEL 法，×200）Fig 3 Apoptosis rate in each group （TUNEL method， ×200）

表2 各组细胞凋亡率（n=3，±s）Tab 2 Rate of apoptosis in TUNEL-positive cells in each group（n=3，±s）

表2 各组细胞凋亡率（n=3，±s）Tab 2 Rate of apoptosis in TUNEL-positive cells in each group（n=3，±s）

注：与对照组相比，**P＜0.01；与模型组相比，#P＜0.05；与LY294002 组相比，△P＜0.05。

细胞凋亡率（%）6.33±1.54 39.58±1.87**11.13±6.40#61.61±12.92#34.72±11.00△22.7＜0.001组别对照组模型组TSG 组LY294002 组LY294002+TSG 组F P

2.4 二苯乙烯苷对各组细胞中信号通路蛋白的表达情况

与对照组相比，模型组P-PI3K（Y607）/ PI3K、P-AKT（Ser473）/AKT 蛋白相对表达量显著减少（P＜0.01）；与模型组相比，TSG 组P-PI3K（Y607）/PI3K、P-AKT（Ser473）/AKT 蛋白相对表达量显著增加（P＜0.01），LY294002 组P-PI3K（Y607）/ PI3K蛋白相对表达量显著减少（P＜0.01），P-AKT（Ser473）/AKT 蛋白相对表达量可见较明显下降，未有统计学差异（P＞0.05）；与LY294002 组相比，LY294002+TSG 组P-PI3K（Y607）/PI3K、P-AKT（Ser473）/AKT 蛋 白 相 对 表 达 量 显 著 增 加（P＜0.05）。见图4。

图4 各组细胞蛋白表达比较Fig 4 Comparison of protein expression in cells of each group

2.5 二苯乙烯苷对各组细胞凋亡蛋白的表达情况

与对照组相比，模型组Bcl-2/Bax 蛋白相对表达量显著下降（P＜0.01）；与模型组相比，TSG 组Bcl-2/Bax 蛋白相对表达量显著上升（P＜0.01），LY294002 组Bcl-2/Bax 蛋白相对表达量可见较明显下降，未有统计学差异（P＞0.05）；与LY294002组相比，LY294002+TSG 组Bcl-2/Bax 蛋白相对表达量显著上升（P＜0.01）。见图4。

2.6 二苯乙烯苷对各组细胞PI3K、AKT mRNA 的表达

与对照组相比，模型组PI3K、AKT mRNA 相对表达量显著减少（P＜0.01）；与模型组相比，TSG组PI3K、AKT mRNA 相对表达量显著增加（P＜0.05），LY294002 组PI3K、AKT mRNA 相对表达量显 著 减 少（P＜0.05）；与LY294002 组 相 比，LY294002+TSG 组PI3K、AKT mRNA 相 对 表 达量显著增加（P＜0.05）。见表3。

2.7 二苯乙烯苷对各组细胞凋亡因子mRNA的表达

与对照组相比，模型组Bcl-2 mRNA 相对表达量显著下降，Bax mRNA 相对表达量显著增加（均P＜0.01）；与模型组相比，TSG 组Bcl-2 mRNA 相对表达量显著增加（P＜0.01），Bax mRNA 相对表达表 达 显 著 下 降（P＜0.05），LY294002 组Bcl-2 mRNA 相 对 表 达 量 显 著 下 降（P＜0.01），Bax mRNA 相 对 表 达 量 显 著 增 加（P＜0.05）；与LY294002 组 相 比，LY294002+TSG 组 Bcl-2 mRNA 相 对 表 达 量 显 著 增 加（P＜0.01），Bax mRNA 相对表达表达量显著下降（P＜0.05）。见表3。

表3 各组细胞PI3K、AKT 及凋亡因子mRNA 相对表达比较（n=3，±s）Tab 3 Comparison of relative expression of PI3K， AKT and apoptosis factor mRNA in cells of each group（n=3，±s）

表3 各组细胞PI3K、AKT 及凋亡因子mRNA 相对表达比较（n=3，±s）Tab 3 Comparison of relative expression of PI3K， AKT and apoptosis factor mRNA in cells of each group（n=3，±s）

注：与对照组相比，**P＜0.01；与模型组相比，##P＜0.01；与LY294002 组相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

Bax 1.00±0.00 8.86±2.75**3.53±0.74#13.90±1.86#7.84±0.99△△29.86＜0.001组别对照组模型组TSG 组LY294002 组LY294002＋TSG 组F P PI3K 1.00±0.00 0.51±0.10**0.90±0.15##0.25±0.04#0.53±0.07△32.76＜0.001 AKT 1.00±0.00 0.46±0.08**0.78±0.10#0.21±0.04##0.37±0.11△57.91＜0.001 Bcl-2 1.00±0.00 0.45±0.06**0.83±0.11##0.18±0.02##0.43±0.07△64.02＜0.001

3 讨论

PI3K/AKT 信号通路具有广泛的功能，如调节细胞存活、细胞增殖、生长、分化、运动、细胞内运输以及更复杂的过程等。PI3K 是细胞内重要的信号转导分子，分为 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类，以Ⅰ类最为重要和常用，可被神经生长因子、胰岛素等信号通路激活，I类亚型是由调节亚基（P85）和催化亚基（P110）组成的异二聚体［13］，根据其调节模式进一步分为ⅠA 类（PI3K α，β 和δ）和ⅠB 类（PI3Kγ），调节亚基P85 通过其SH2 结构域与活化受体上的磷酸化酪氨酸残基结合，然后募集催化亚基P110 以形成完全活性的PI3K 酶［13］。当神经营养因子或胞外生长因子与跨膜的酪氨酸激酶受体（RTKs）结合后，RTKs 则会发生自身磷酸化，从而募集PI3K 至RTKs 磷酸化部位［14］。 PI3K/AKT 通 路 的 激 活 始 于RTK 激 活PI3K，被激活的PI3K 可活化AKT，AKT 结构的构象变化暴露了Thr308 和Ser473 的磷酸化位点，导致Thr308 残基被PDK1 磷酸化，并在Ser473 处进行第二次磷酸化。活化的AKT 通过激活或者抑制作用调节下游靶蛋白Bcl-2（B 细胞淋巴瘤／白血病-2）；Bcl-2xL（B 细胞淋巴瘤因子-2XL）等活性，从而参与细胞凋亡的调控［15，16］。此条通路与AD 发病机 制 具 有 密 切 联 系，其 中Wang 等［17］发 现 激 活PI3K/AKT 信号通路可以改善AD 小鼠神经炎症反应和认知障碍，郭学军等［18］研究表明激活PI3K/AKT 信号通路可以降低AD 小鼠脑神经凋亡。本实验选取PI3K P110 催化亚基、AKT Ser473 磷酸化位点进行蛋白检测，并发现加入PI3K 抑制剂后P-PI3K/PI3K、P-AKT/AKT 蛋白表达比值明显降低，经TSG 干预后P-PI3K/PI3K、P-AKT/AKT 蛋白表达比值明显升高，提示TSG 可能通过激活PI3K/AKT 信号通路而减少细胞凋亡。

比起正常衰老人群，神经元大量丢失在AD 患者群体中更加明显。对于AD 神经元丢失的机制尚未有广泛定论，目前主流的形式有细胞凋亡、坏死、焦亡及其他形式的细胞死亡（如铁死亡、铜死亡等）［16］。本实验选取在AD 神经元丢失机制中探索最广泛的细胞凋亡进行研究，采用OA 对人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y 进行诱导，SH-SY5Y 细胞是一种易于处理和增殖的细胞系，具有成熟的分化方法，可生成稳定的神经元培养物［19］，获得成熟神经元样特征，该细胞系通常被运用于神经退行性疾病发病机制的研究中。OA 作为一种蛋白磷酸酶抑制剂，可抑制磷酸酶的活性，体内外实验表明，OA 能诱导Tau 蛋白磷酸化，可用于建立AD 样细胞研究模型［20，21］。在本实验中，与模型组相比，TSG 组细胞活力增加，凋亡率显著下降，PI3K/AKT 通路蛋白和基因表达显著上升，提示TSG 可能通过干预PI3K/AKT 通路而一定程度上减少细胞凋亡。LY294002 作为PI3K/AKT 通路抑制剂，可促进细胞凋亡，抑制PI3K/AKT 信号通路的蛋白和基因水平，相比于LY294002 组，LY294002＋TSG 组细胞凋亡减少，PI3K/AKT 信号通路蛋白和基因表达均出现上升，进一步证明TSG 对于减少细胞凋亡的作用是通过PI3K/AKT 信号通路体现的。

综上所述，TSG 可能通过干预PI3K/AKT 信号通路，从而一定程度上抑制细胞凋亡。未来可以继续探索TSG 对PI3K/AKT 上下游信号分子的影响，充分阐明其具体的作用机制。

作者贡献度说明：

黄忠仕：实验设计及文章审校；朱晓莹、李振中：提供Western blot 实验技术指导；李悦、何晓璇：负责细胞培养、药物干预；肖振、胡睿、罗陈亮、乔明宇、吴桂有：负责指标检测、数据分析；康碧倩：撰写论文。

所有作者声明不存在利益冲突关系。