胃饥饿素通过miR-455-5p 靶向IGF-1R 调控肝细胞胰岛素敏感性的作用及机制研究

郭展宏，居悦俊，沈 婷，张琳琪，盛忠奇，吴润泽，孔颖宏

（江苏省常熟市第二人民医院内分泌科，江苏 常熟 215500）

糖尿病与遗传易感性或不健康的生活方式有关。根据国际糖尿病联盟（international diabetes federation，IDF）的数据，全球有超过4 亿人口患有糖尿病，其中90%是2 型糖尿病［1］。胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）被认为是引起2 型糖尿病的主要原因之一。肝脏是葡萄糖储存和代谢的关键器官。IR 可导致肝脏葡萄糖代谢异常，从而加快2 型糖 尿病的 进展［2］。磷 脂酰肌醇3 激酶（phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信号通路调节细胞增殖、分化以及代谢［3］，它在胰岛素对血糖的调节、葡萄糖转运蛋白的激活、促进糖原合成和调节糖酵解过程中发挥关键作用［4］。PI3K/Akt 通路的信号转导异常与许多人类疾病密切相关，包括2 型糖尿病、肥胖症和癌症等［3］。 胰 岛 素 样 生 长 因 子-1 受 体（insulin-like growth factor-1 receptor，IGF-1R）是一种酪氨酸激酶受体［5］，它激活下游的PI3K/Akt 通路，提高机体的胰岛素敏感性［6］。

微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是非编码内源性RNA，通过结合靶点的3'非翻译区抑制或切割靶点mRNA，从而调节基因表达。最近的研究发现，一些miRNA 是人类IGF-1R mRNA 的负性调节因 子，包 括miR-130a-3p［7］和miR-520b［8］。研 究 发现，miR-455-5p 的上调可能通过抑制肝细胞癌中的IGF-1R 信号转导，抑制糖酵解或葡萄糖摄取［9］。一项针对中国2 型糖尿病患者的研究显示，miR-455-5p 在 这 些 患 者 中 高 表 达［10］。miR-455-5p的上调可能抑制许多与代谢有关的生物过程，包括脂肪生成和胰岛素信号通路［11］。以上研究证明了miR-455-5p 与2 型糖尿病之间存在密切的相关性。然而，miR-455-5p 如何影响胰岛素敏感性的分子机制仍需进一步阐明。

去酰基化胃饥饿素（des-acyl ghrelin，DAG）是由胃底黏膜分泌的一种脑肠肽，它参与调节许多代谢过程［12］。临床研究表明，在节食减肥后，较高水平的DAG 可以改善肥胖个体的胰岛素敏感性［13］。研究证实，长期外源性应用DAG 可以稳定血糖和胰岛素水平［14］，并改善胰岛素敏感性，这可能与DAG 调节胰岛素抵抗状态下的氧化应激和炎症反应有关［15］。然而，DAG 改善胰岛素抵抗的确切机制仍不清楚。

人肝癌细胞系（HepG2）已广泛用于肝细胞葡萄糖稳态的研究，包括肝葡萄糖产生和胰岛素信号通路的调节等。本研究构建了一个胰岛素抵抗的HepG2 细胞模型，以探究DAG 对胰岛素抵抗的调节以及miR-455-5p/IGF-1R/PI3K 信号通路在这一过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞培养及处理

HepG2 细胞系购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库，在含5% CO2以及37 ℃培养箱条件下，采用含10%胎牛血清（Bovogen Biologicals，Australia）和1% 抗生素（青霉素和链霉素）的DMEM（Gibco， USA）进 行 培 养。 使 用 含5.5 mmol/L（正常对照组）或30 mmol/L 葡萄糖（胰岛素抵抗组及药物干预组）的DMEM 进行培养，并加入高胰岛素（100 nmol/L）构建胰岛素抵抗的HepG2 细胞模型；在胰岛素抵抗组及药干预组培养基中加入1 μmol/L DAG（Cozmo-Lab，USA）后培养48 h，以评估DAG 对葡萄糖代谢的影响。用100 nmol/L 胰岛素处理0.5 h 后收取细胞。

1.2 细胞转染

miR-455-5p 模拟物或抑制剂由PPL 质粒与蛋白共享库（南京）合成，并使用LipofectamineTM3000转染试剂（Invitrogen，USA）转染进入HepG2 细胞中。转染24 h 后，使用miRNA 荧光原位杂交（Fluorescencein situ hybridization，FISH）检测miR-455-5p的表达水平，以验证转染是否成功。Western Blot法检测IGF-1R、PI3K/Akt 信号通路的表达水平。

1.3 miRNA 荧光原位杂交

针对miR-455-5p 的异硫氰酸荧光素（FITC）标记特异性探针由上海生工生物（Sangon Biotech）设计并合成。使用FISH 试剂盒（RiboBio Corporation）进行miR-455-5p FISH 检测。细胞图像使用共聚焦显微镜（Nikon，Japan）拍摄。

1.4 细胞活性检测

使用MTT 检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）检测采用不同浓度DAG（从0 到4 μmol/L）处理的HepG2 细胞的存活率。细胞在DAG（0、0.5、1.0、2.0 和4.0 μmol/L）中 孵 育24 h。随 后 加 入MTT 溶液（5 mg/mL，20 μL/孔）并孵育4 h。去除上清液，每孔加入110 μL 甲臜（Formazan）溶液，低速震荡10 min，使用多功能微孔板读数仪（PerkinElmer，USA）记录490 nm 处的吸光度。

1.5 葡萄糖消耗量测定

转染24 h 后，使用葡萄糖含量检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）测定培养基中的葡萄糖含量，根据如下公式计算出各组HepG2 细胞葡萄糖消耗量：葡萄糖消耗量（mmol/L）=空白组葡萄糖含量（mmol/L）-各组葡萄糖含量（mmol/L）。使用多功能微孔板读数仪（PerkinElmer，USA）记录505 nm 处的吸光度。

1.6 糖原含量测定

使用糖原检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）测定糖原含量。按说明书操作，使用多功能微孔板读数仪（PerkinElmer，USA）记录620 nm 处的吸光度。计算糖原含量并以μg/106细胞表示。

1.7 双荧光素酶报告基因实验

使 用TargetScanHuman 软 件（版 本7.2）预 测miR-455-5p 靶向IGF-1R 基因。进行双荧光素酶报告基因实验以确认miR-455-5p 靶向IGF-1R mRNA 3'-UTR。将野生型（WT）和突变型（MUT）的IGF-1R 3'UTR 分别克隆到psiCHECK-2 载体（Promega，USA）中。该载体包含萤火虫荧光素酶报告基因和海肾荧光素酶基因。然后，使用LipofectamineTM 3000 转 染 试 剂（Invitrogen，USA）将miR-455-5p 模拟物或其对照（5 pM）、报告基因质粒IGF-1R-WT（0.16 μg/孔）或IGF-1R-MUT（0.16 μg/孔）转染到HepG2 细胞中。24 h 后，检测相对荧光素酶活性。

1.8 Western Blot

转染48 h 后，收集HepG2 细胞并在RIPA 缓冲液（北京索莱宝科技有限公司）中裂解。使用BCA检测试剂盒（Thermo Fisher，USA）测定总蛋白浓度。蛋白样品在SDS-PAGE（北京索莱宝科技有限公司）中分离，随后转移到0.22 μm PVDF 膜（Amresco，USA）上。PVDF 膜在4 ℃条件下加入一抗中孵育过夜，然后在室温下加入二抗中孵育1 h。使用凝胶成像系统（Syngene，USA）进行化学发光成像。一抗：p-PI3K（1∶1 000，#13857，CST，USA）、PI3K（1∶1 000，#4249，CST，USA）、p-Akt（1∶1 000，#9271，CST，USA）、Akt（1∶1 000，#9272，CST，USA）、IGF-1R（1∶1 000，#AP59586，苏州百远生物科技有限公司）、GAPDH（1∶2 500，ab9485，Abcam，UK）。

1.9 统计学处理

使 用GraphPad Prism 9.0 （GraphPad Software Inc.， USA） 软件进行统计分析。所有实验都重复3次，结果表示为（±s）。通过单因素方差分析（ANOVA）和非配对t检验计算P值。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 DAG 对细胞活性的影响

使用MTT 检测试剂盒检测DAG 对HepG2 细胞的毒性作用。将HepG2 细胞置于含一系列不同浓度DAG（0.5、1.0、2.0 以及4.0 μmol/L）的培养液中孵育24 h。结果显示细胞存活率未发生变化（图1A、表1）。说明本研究中使用的DAG 浓度（1 μmol/L）不会对细胞造成损害。

2.2 DAG 改善高糖诱导的HepG2 细胞的胰岛素敏感性

多项研究表明，DAG 促进葡萄糖消耗，并在多种细胞中上调胰岛素依赖的信号通路［14，15］。使用HepG2 细胞建立了胰岛素抵抗模型，然后应用DAG（1 μmol/L）进行干预。与正常对照组相比，高糖（30 mmol/L）状态下HepG2 细胞的葡萄糖消耗明显降低，从胰岛素刺激后的1 h 开始下降，并在12 h 达到最大值（图1B、表2）。高糖（30 mmol/L）条件下处理48 h 显著降低了葡萄糖消耗量（图1C、表3）和细胞内糖原含量（图1D、表3）。同时，IGF-1R、p-PI3K 和p-Akt 的表达也明显下降（图1E），这与前人研究的结果一致［16］.DAG （1 μmol/L） 显著增加了葡萄糖消耗量（图1C、表3）和细胞内糖原含量（图1D、表3），并增加了高糖条件下IGF-1R、p-PI3K 和p-Akt 的表达（图1E）。这些结果表明DAG 可能通过上调IGF-1R/P13K/Akt 通路来改善胰岛素敏感性。

2.3 IGF-1R 是miR-455-5p 的直接靶基因

生物信息学分析预测了miR-455-5p 可与IGF-1R 3'-UTR 上的特定位点结合（图2A）。为了验证miR-455-5p 是否靶向IGF-1R，进行双荧光素酶报告基因实验。与正常对照模拟物组（NC mimic）相比，IGF-1R-WT/miR-455-5p 共转染后的荧光素酶活性明显降低（图2B）。共转染miR-455-5p 和IGF-1R-MUT 后，荧光素酶活性保持不变（图2B）。Western Blot 实验证实了上调miR-455-5p 对IGF-1R 表达的影响。miR-455-5p 上调后，IGF-1R蛋白水平明显降低（图2C）。以上结果表明IGF-1R是miR-455-5p 的直接靶基因。

2.4 DAG 通过miR-455-5p 介导的IGF-1R/PI3K/Akt 信号通路改善高糖诱导的胰岛素抵抗

图1 高糖培养诱导HepG2 细胞胰岛素抵抗Fig 1 Insulin resistant HepG2 cells induced by high glucose

表1 HepG2 细胞活性测定Tab 1 The viability of HepG2 cells

为了明确miR-455-5p 在DAG 改善胰岛素抵抗过程中的作用机制，检测了miR-455-5p 以及总IGF-1R、p-PI3K 和p-Akt的蛋白水平的变化。在高糖条件下，miR-455-5p 表达上调（图1F）。使用DAG（1 μmol/L）连 续 干 预48 h 后，HepG2 细 胞 中 的miR-455-5p 高表达被部分逆转（图1F）。同时，IGF-1R、p-PI3K 和p-Akt 的蛋白表达水平升高（图1E）。 然 后 分 别 使 用miR-455-5p 的 模 拟 物（miR-455-5p mimic）或抑制剂（miR-455-5p inhibitor）过表达或沉默miR-455-5p，并通过FISH 检测miR-455-5p的表达（图3A，图4A）。以上结果表明，过表达miR-455-5p部分逆转了DAG 对IGF-1R/PI3K/Akt信号通路的影响（图3D），降低了葡萄糖消耗量和细胞内糖原含量（图3B，图3C、表3）。miR-455-5p 抑制剂提高了IGF-1R、p-PI3K 和p-Akt的表达（图4D），促进了葡萄糖消耗和糖原合成（图4B，图4C、表3）。以上结果表明，DAG 可能通过下调miR-455-5p 的表达，从而激活IGF-1R/PI3K/Akt信号通路，部分改善高糖诱导的HepG2细胞的胰岛素抵抗。

图2 miR-455-5p 与IGF-1R 的靶向关系Fig 2 Target relationship between miR-455-5p and IGF-1R

表2 高糖培养的HepG2 细胞（胰岛素抵抗组）以及正常对照组在胰岛素刺激后葡萄糖消耗的时间曲线Tab 2 Time-course profiles of glucose consumption after stimulation with insulin under high glucose condition （IR group） compared to those in the control group

表3 各组HepG2 细胞的葡萄糖消耗量和细胞内糖原含量Tab 3 Glucose consumption and glycogen content of HepG2 cells in each group

图3 miR-455-5p 过表达部分阻断了DAG 对胰岛素敏感性的改善作用Fig 3 miR-455-5p overexpression partially prevents the ameliorative effect of DAG on insulin sensitivity

图4 抑制miR-455-5p 部分消除了高糖对IGF-1R 信号通路的抑制作用Fig 4 miR-455-5p inhibitor partially abolishes the inhibitory effect of high glucose on the IGF-1R pathway

3 讨论

近年来，随着生活方式的改变，2 型糖尿病（T2DM）的发病率在全球范围内迅速增加，仍然是全球重要的公共卫生问题［17］。胰岛素抵抗是T2DM 的重要病理生理机制。肝脏在维持机体葡萄糖稳态中起着重要作用，也是胰岛素作用的最关键靶器官之一［18］。肝脏胰岛素抵抗被认为是导致葡萄糖摄取和利用受损的主要因素，进而引发代偿性高胰岛素血症、糖原储备下降和糖异生增加［19］。因此，改善肝脏葡萄糖代谢对于缓解T2DM 患者的胰岛素抵抗具有重要意义。胃饥饿素（Ghrelin）于1999 年被首次发现，最初被认为可以促进生长激素的分泌［20］。酰化胃饥饿素（acyl ghrelin，AG）通过激活GHS-R1a 受体，调节摄食行为、能量平衡和胃肠蠕动，发挥广泛的生理作用［21］。去酰化胃饥饿素（des-acyl ghrelin，DAG）在调节能量平衡、胃肠动力等方面对AG 具有拮抗作用［22］。此外，DAG 对血糖稳态也具有有益影响，可以降低血糖水平并改善胰岛素抵抗［23］。本研究发现：（1） DAG 改善高糖诱导的胰岛素抵抗。（2） DAG 通过激活PI3K/Akt 信号通路促进葡萄糖摄取和糖原合成。（3） DAG 可能通过下调miR-455-5p 的表达，从而激活IGF-1R/PI3K/Akt 通 路，这 可 能 是DAG 改 善HepG2 细 胞 胰岛素抵抗的潜在机制。

IGF-1R 是一种跨膜糖蛋白，属于酪氨酸激酶受体家族，通过激活PI3K/Akt 通路调节细胞生长和能量代谢［24，25］。Akt 通过对磷酸化下游的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase， PEPCK）、葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase， G6Pase）和糖原合酶激酶3（glycogen synthase kinase 3β， GSK-3β），调节糖原合成和糖异生过程［19，26］。胰岛素抵抗HepG2 细胞中的IGF-1R 蛋白水平显著降低。总PI3K 和Akt 并未明显改变，但在高糖条件下，PI3K/Akt 通路的磷酸化水平明显下降，这与相关研究［16］结论一致。PI3K/Akt 信号通路的失调导致葡萄糖代谢失衡，抑制葡萄糖摄取和糖原合成。已有研究证实了外源性DAG 干预可以增强葡萄糖摄取和胰岛素敏感性［23，27］。研究结果显示，DAG 上调了IGF-1R 的水平，并增强了PI3K/Akt 信号通路的磷酸化水平，从而促进了葡萄糖摄取和糖原合成。

miRNA 参与调控机体胰岛素敏感性。例如，高脂饮食导致胰岛素抵抗和葡萄糖代谢异常，与miRNA 的失调有关，包括miR-27a［28］、miR-29b-3p［29］和miR-144［30］。研 究 表 明miR-455-5p 可 以 通 过 下 调IGF-1R/Akt/GLUT 信号通路来抑制肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）的葡萄糖摄取［9］，这与研究结果一致。本文重点研究了miR-455-5p通过抑制胰岛素抵抗HepG2 细胞中的IGF-1R 来调节胰岛素敏感性。验证了miR-455-5p 可直接结合IGF-1R mRNA 的3'UTR。本研究发现，在胰岛素抵抗状态下，miR-455-5p 表达明显增加，而IGF-1R蛋白表达量显著减少。抑制IGF-1R 蛋白表达将导致PI3K/Akt 信号通路的磷酸化水平降低，进而降低葡萄糖摄取和糖原合成。转染miR-455-5p 抑制剂/模拟物可分别上调/下调IGF-1R 的蛋白表达。miR-455-5p 抑制剂可部分逆转高糖诱导的IGF-1R的蛋白表达下降，提高PI3K/Akt 信号通路的磷酸化水平，进而增加葡萄糖摄取和糖原合成。研究结果表明，下调miR-455-5p 有助于激活IGF-1R 及其下游的PI3K/Akt 信号通路，从而改善胰岛素抵抗。

DAG 显著降低了高糖诱导的HepG2 细胞中miR-455-5p 的表达，表明DAG 介导的miR-455-5p下调可能有助于其对改善胰岛素抵抗的作用。上调miR-455-5p 的表达逆转了DAG 对胰岛素抵抗的改善作用。miR-455-5p 抑制剂部分消除了高糖对IGF-1R/PI3K/Akt 通路的抑制作用。这些结果表明，DAG 可能通过下调miR-455-5p 的表达来改善高糖诱导的IGF-1R/PI3K/Akt 信号通路失调，这可能是改善胰岛素抵抗和2 型糖尿病患者血糖水平的潜在治疗靶点。

综上所述，本研究发现高葡萄糖条件可上调HepG2 细胞中miR-455-5p 的表达，降低了IGF-1R蛋白水平、p-PI3K 以及p-Akt 的表达，从而抑制了胰岛素信号传导，最终导致胰岛素抵抗发生。DAG 通过干预miR-455-5p/IGF-1R 信号通路，改善HepG2细胞中的胰岛素抵抗。本研究结果表明，抑制miR-455-5p 或上调DAG 可能是2 型糖尿病的潜在治疗靶点。

作者贡献度说明：

郭展宏、居悦俊：实验设计与论文撰写；沈婷、吴润泽：细胞培养与转染；张琳琪、盛忠奇：细胞实验相关指标检测与数据分析；孔颖宏：实验设计指导与论文修改。

所有作者声明不存在利益冲突关系。