苓桂术甘汤干预非酒精性脂肪肝病的药效学研究及作用机制探讨

赵传志，丁慧敏，胡紫晴，都永勤，周 兰，周 鹏，王 靓

（安徽中医药大学中西医结合学院，安徽 合肥 230012）

非酒精脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）作为全球常见的慢性肝病，对全球社会造成了巨大的经济负担［1］。最近的一项分析报告显示，全球成年人的患病率大约为32%且随着时间的推移而增加［2］。目前对于NAFLD 的发病机制主要集中在脂质积累［3］、胰岛素抵抗［4］、氧化应激［5］、内质网应激［6］及肝脏炎症及纤维化［7］等。目前临床对于NAFLD 的治疗包括调节糖脂代谢以及保护肝脏和抗炎等方式进行。

网络药理学作为一种新兴学科，其利用了网络理念对中药复方的作用机制及生物学基础进行系统研究，特点是系统性、相关性及可预测性［8］。网络药理学常用于中药复方制剂中有效活性成分与特定疾病靶向基因之间的相互作用［9］。分子对接是一种在分子水平上预测配体和靶标相互作用或描绘构效关系的基于计算机结构的技术，故其可作为网络药理学活性成分及靶点关系验证［10］。

苓桂术甘汤始记载于《金匮要略》［11］，由茯苓、桂枝、白术、甘草四味药材组成，其主要功效为温阳健脾以助化饮、淡渗利湿以平冲逆，故苓桂术甘汤可通过温阳化饮、运化水谷进而调节血脂。临床研究表明苓桂术甘汤可与其他药物或饮食联合治疗NAFLD［12，13］。基 础 研 究 表 明 苓 桂 术 甘 汤 可 通 过Thrsp-Srebp1 信号通路、STING-TBK1-NF-κB 信号通路改善NAFLD［14，15］。因中药复方同时具有多成分、多途径、多靶点综合干预的特点，且中医辩证治疗的整体观与以网络和系统为特征的网络药理学研究观念相吻合。故本研究使用动物实验对其进行药效学评价，在此基础上使用网络药理学及分子对接技术，对苓桂术甘汤干预NAFLD 的靶点、活性成分进行分析。为进一步探究苓桂术甘汤干预NAFLD 的机制提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 动物实验

1.1.1 药物与试剂 苓桂术甘汤（茯苓、桂枝、白术、甘草，质量比4∶3∶3∶2），饮片均购自安徽敬道生物科技有限公司，白术批号为220801，桂枝批号为210902，茯苓批号为220701，甘草批号为210501；根据课题组前期的提取工艺［16］，将苓桂术甘汤制备成含4.8 g 生药的干浸膏，密封后于4 ℃的冰箱保存备用。辛伐他汀购自国药集团容生制药有限公司，批号为22040511；高脂饲料购自安徽合肥青源生物科技有限公司，高脂饲料配方为（质量分数）：猪油5%、糖5%、蛋黄粉5%、胆固醇1%、基础维持饲料84%。正常饮食饲料（基础维持饲料）购自北京华阜康生物科技股份有限公司，批号为2210220909。谷丙转氨酶（GPT）试剂盒（批号：20221114）、谷草转氨酶（GOT）试剂盒（批号：20221115）、甘油三酯（TG）试剂盒（批号：20221108）、总胆固醇（T-CHO）试剂盒（批号：20220909）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）试剂盒（批号：20220912）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）试剂盒（批号：20220912）均购自南京建成生物工程研究所。

1.1.2 动 物 SPF 级 雄 性SD 大 鼠60 只，体 重（180～220）g，由郑州市华兴实验动物养殖场提供，实验动物生产许可证为：SCXK（豫）2019-0002。动物实验经安徽中医药大学动物实验伦理委员会审查、批准，动物伦理编号为：AHUCM-rats-2022085。

1.1.3 实验仪器 BX51 显微镜（日本Olympus 公司）；电热恒温鼓风干燥箱（上海三发科学仪器有限公司）；FA2104B 电子分析天平（上海越平科学仪器有限公司）；TS-12A 生物组织自动脱水机（中国宏业医用仪器有限公司）；徕卡 RM2016 型轮转式切片机（中国徕卡仪器有限公司）；BM-IX 生物组织包埋机（中国宏业医用仪器有限公司）；YD-AB 摊片烤片机（金华市益迪医疗设备有限公司）；318C＋酶标仪（上海沛欧分析仪器有限公司）。

1.1.4 NAFLD 大鼠模型建立、分组及给药 SPF级雄性SD 大鼠给予高脂饲料喂养20 周建立NAFLD 大鼠模型［17］。将高脂喂养 12 周的SD 大鼠随机均分为5 组：模型组、辛伐他汀组、苓桂术甘汤低剂量组、苓桂术甘汤中剂量组、苓桂术甘汤高剂量组。其中辛伐他汀剂量为4 mg/kg。苓桂术甘汤剂量分别为2.1 g、4.2 g 和8.4 g 生药/kg（按体表面积计算相当于临床等效量的1、2、4 倍），各治疗组于第13 周分别称重后灌胃给予相应药物，正常组和模型组给予蒸馏水，连续8 周。给药结束后，戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉大鼠，腹主动脉取血，取一部分肝脏于4 %多聚甲醛固定，用于HE 染色实验、油红O 染色实验。其余肝脏液氮速冻后置于-80 ℃冰箱冻存备用。

1.1.5 肝功能指标检测 按照GOT、GPT 等试剂盒说明书检测各组大鼠血清GOT、GPT 水平。

1.1.6 肝组织形态学观察 将固定在4%多聚甲醛中的组织取出，用于油红O 染色、HE 染色。

1.1.7 生化指标检测 按照TC、TG、HDL-C、LDL-C 等试剂盒说明书检测各组大鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平。

1.1.8 统计学处理 通过Graphpad Prime8 软件进行处理，多组间比较采用单因素方差分析。

1.2 网络药理学

1.2.1 筛选苓桂术甘汤活性成分及相关靶点 登录 中 药 综 合 数 据 库［18］（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）分别对茯苓、桂枝、白术、甘草4 味中药的化学成分进行检索，获得复方的活性成分信息。根据TCMSP 药物筛选标准，以口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30% 及药物相似性（Drug likeness，DL）≥0.18 为过滤条件筛选有效成分，再 利 用SwissTargetPredicition 数 据 库［19］（http：//www.swisstargetprediction.cn/）对其活性成分进行靶点预测，并利用Cytoscape3.7.2 软件构建“苓桂术甘汤-有效成分-靶点”图［20］。

1.2.2 非酒精性脂肪肝病靶点筛选 从GeneCards数 据 库［21］（https：//www.genecards.org）中 以“Nonalcoholic fatty liver disease”为关键词筛选非酒精性脂肪肝病靶点。

1.2.3 苓桂术甘汤干预NAFLD 的靶点预测 通过网站［22］（http：//jvenn.toulouse.inra.fr/app）将苓桂术甘汤活性成分对应靶点及疾病靶点进行映射以得到共同靶点。

1.2.4 蛋白相互作用网络构建及网络拓扑学分析将 共 同 靶 点 导 入STRING 数 据 库［23］（https：//string-db.org） ，构 建 蛋 白 质 相 互 作 用（protein-protein interaction，PPI）网络。并将其导入Cytoscape3.7.2 软件使其可视化，经过CytoNCA 插件拓扑分析，以所有交集靶点的中心性（Degree centrality，DC）和 间 中 心 性（Betweenness centrality，BC）的中位值筛选核心靶点。

1.2.5 GO 功能与KEGG 通路富集分析 使用Metascape 数 据 库［24］（https：//metascape.org/）对1.2.3 所得出的共同靶点进行GO 功能及KEGG 通路富集分析，设定物种为“Homo sapiens”，使用微生信网（http：//www.bioinformatics.com.cn/）对前二十条目进行可视化绘制。

1.3 分子对接

1.3.1 中药活性成分处理 将苓桂术甘汤及其对应靶点在Cytoscape3.7.2 软件中经CytoNCA 插件进行网络拓扑分析，根据度值筛选其前二十的活性成分。登录TCMSP 下载这些活性成分的二维结构图。准 备 使 用CB-Dock 网 站［25］（clab.labshare.cn/cb-dock/php/download.php）进行分子对接。

1.3.2 靶点蛋白结构预测及筛选 根据文献选择ALB、TNF、IL6、AKT1、PPARG、VEGFA、EGFR、ESR1、SIRT1、STAT3 等蛋白的晶体结构［26-31］，并根据PDB ID 从RCSB 蛋白质数据库（RCSB PDB）中获得其晶体结构。

1.3.3 分子对接 将苓桂术甘汤前二十活性成分及前十核心靶点导入CB-Dock（clab.labshare.cn/cb-dock/php/download.php）平台进行对接，保存其对接结果。

2 结果

2.1 动物实验结果

2.1.1 苓桂术甘汤对NAFLD 大鼠肝功能影响 与正常组相比，模型组大鼠血清中GOT、GPT 水平明显升高；与模型组相比，辛伐他汀组、苓桂术甘汤低剂量组、苓桂术甘汤中剂量组、苓桂术甘汤高剂量组大鼠血清中GOT、GPT 水平明显降低。见图1。

图1 苓桂术甘汤对NAFLD 大鼠肝功能影响Fig 1 Effects of Linggui Zhugan Decoction on liver function in rats with NAFLD

2.1.2 苓桂术甘汤对NAFLD 大鼠肝组织病理影响 根据HE 染色结果，正常组肝组织结构清晰，而模型组肝组织中肝细胞体积增大、胞质内可见大小不一圆形脂肪空泡；而辛伐他汀组、苓桂术甘汤低剂量组、苓桂术甘汤中剂量组、苓桂术甘汤高剂量组肝组织损伤较模型组有所缓解。油红O 染色结果显示，模型组肝脏蓄积大量脂质，经过辛伐他汀、苓桂术甘汤干预的大鼠肝组织脂质蓄积有所改善。 见图2。

图2 苓桂术甘汤对NAFLD 大鼠肝组织病理影响Fig 2 Effect of Linggui Zhugan Decoction on liver histopathology in rats with NAFLD

2.1.3 苓桂术甘汤对NAFLD 大鼠血清中TC、TG、HDL、LDL 的影响 与正常组相比，模型组大鼠血清中TC、TG、HDL 水平明显升高，LDL 水平显著下降；与模型组相比，辛伐他汀组、苓桂术甘汤低剂量组、苓桂术甘汤中剂量组、苓桂术甘汤高剂量组大鼠血清中TC、TG、HDL 水平明显降低，LDL 水平明显升高。见图3。

图3 苓桂术甘汤对NAFLD 大鼠血清中TC、TG、HDL、LDL 的影响Fig 3 Effects of Linggui Zhugan Decoction on TC， TG， HDL， and LDL in serum of rats with NAFLD

2.2 网络药理学结果

2.2.1 苓桂术甘汤主要成分及靶点分析 从中药综合数据库中共筛选出茯苓、桂枝、白术、甘草主要有效活性成分121 个。剔除无靶点成分18 个，将103 个活性成分导入SwissTargetPredicition 数据库进行靶点预测，最终获得886 个潜在靶点。将103个活性成分及886 个潜在作用靶点导入Cytoscape3.7.2 软件，构建“苓桂术甘汤-有效活性成分-潜在作用靶点”图。见图4。

2.2.2 非酒精性脂肪肝病靶点分析 从GeneCards数据库中以“Nonalcoholic fatty liver disease”为关键词筛选非酒精性脂肪肝病靶点并对其进行中位值筛选，得出靶点543 个。

2.2.3 苓桂术甘汤潜在作用靶点及NAFLD 分析将苓桂术甘汤潜在作用靶点及NAFLD 靶点导入jvenn 网站进行韦恩图绘制，得到共同靶点126 个。见图5。

2.2.4 苓桂术甘汤干预非酒精性脂肪肝的靶点网络分析 将126 个共同靶点导入STRING 数据库进行分析，得到PPI 网络图，见图6。将其导入Cytoscape3.7.2 软件进行可视化分析，圆形越大、颜色越深其靶点相关度越高，见图7。使用CytoNCA 插件对其进行网络拓朴学分析，根据DC、BC、EC、CC 选其大于中位值筛选出其核心靶点。见表1。

图4 苓桂术甘汤-有效活性成分-潜在作用靶点Fig 4 Linggui Zhugan Decoction - active active ingredient - potential target

图6 PPI 网络图Fig 6 PPI network diagram

2.2.5 GO 富集与KEGG 通路分析 将126 个共同靶点导入Metascape 数据库进行GO 富集及KEGG通路分析。共获得生物过程（biological process，BP） 1 685 个（主要涉及激酶结合、转录因子结合、核受体活动）、细胞组成（cellular component，CC）115个（主要涉及细胞膜筏、膜微域、转录调节复合体）、分子功能（molecular function，MF） 73 个（主要涉及泛素蛋白连接酶结合、蛋白质结构域特异性结合、泛素样蛋白连接酶结合），见图8。以P＜0.05 为筛选条件得到185 条信号通路，对排名前10 条的信号通路进行可视化分析，见图8。

图5 苓桂术甘汤与NAFLD 靶点映射图Fig 5 Map of Linggui Zhugan Decoction and NAFLD targets

表1 核心靶点网络拓扑学参数Tab 1 Core target network topology parameters

图7 Cytoscape 转化的PPI 网络图Fig 7 Cytoscape converted PPI network diagram

图8 GO 及KEGG 分析Fig 8 GO and KEGG analysis

表2 前二十活性成分信息表Tab 2 Information table for the first twenty active ingredients

2.3 分子对接结果

2.3.1 活性成分信息 经CytoNCA 插件进行网络拓扑分析，根据度值筛选其前二十的活性成分，详细信息见表2。

2.3.2 核心靶点结构信息 根据文献选择ALB、TNF、IL6、AKT1、PPARG、VEGFA、EGFR、ESR1、SIRT1、STAT3 等蛋白的晶体结构，其详细信息如表3 所示。

表3 核心靶点结构信息Tab 3 Core target structure information

2.3.3 分子对接结果 将苓桂术甘汤排名前二十的活性成分分别与10 个核心靶点蛋白进行对接，得到200 组对接结果，使用R 语言对对接评分进行可视化分析，如图9 所示，颜色越趋向于蓝其结合能力越好。部分对接结果如图10 所示。

图9 分子对接评分结果聚类分析Fig 9 Cluster analysis of molecular docking score results.

图10 部分分子对接结果Fig 10 Partial molecular docking results

3 讨论

本实验以高脂饮食诱导的NAFLD 大鼠为研究对象，对其使用苓桂术甘汤及辛伐他汀干预，并检测其血清中血脂四项及肝功能指标，结果显示苓桂术甘汤可显著改善模型大鼠的肝功能且可能是通过降脂这一途径发挥作用。而HE 染色和油红O 染色的结果也显示模型组大鼠脂滴及其脂质沉积较多，经苓桂术甘汤干预可显著改善其脂质沉积。以上结果提示苓桂术甘汤可能通过脂代谢途径干预SD 大鼠NAFLD。

通过网络药理学分析，共筛选出苓桂术甘汤治疗NAFLD 的潜在作用靶点126 个，通过蛋白互作网络及网络拓朴学分析，得出10 个核心蛋白靶点：ALB、TNF、IL6、AKT1、PPARG、VEGFA、EGFR、ESR1、SIRT1、STAT3。相关研究表明，ALB 结合功能是评估NAFLD 早期肝损伤及其进展的新型生物标志物，ALB 结合能力降低可能导致毒性代谢物积累和抗氧化能力差，进而加重NAFLD 肝损伤［32］。TNF 作为一种促炎细胞因子，在自身免疫性疾病中发挥重要作用，其在脂肪组织中过度表达并诱导脂肪细胞释放促炎脂质瘦素，与NAFLD 病情进展密切相关［33］。IL6 作为炎症最为典型的相关因子，其促炎作用可能是通过抑制胰岛素信号传导并调节急性期反应和慢性炎症，相关研究表明其可以促进NAFLD 的发展［34］。AKT 作为细胞活性调节因子，其功能障碍导致糖脂代谢紊乱，原因是其改变了激酶或其他调节葡萄糖和脂质代谢的相关信号分子的下游功能，故抑制AKT 信号通路可能作为治疗NAFLD 的 手 段［35］。PPARα 在 控 制 脂 质 转 运 和 代谢中占据重要作用，特别是通过激活线粒体和脂肪酸β 氧化途径可维持肝脏脂质水平的正常平衡，避免其脂质沉积［36］。血管内皮生长因子A（VEGFA）在NAFLD 和肝细胞癌中起关键作用，其激活可能加快NAFLD 转向肝细胞癌的发展［37］。EGFR 常表达于上皮细胞，有研究表明EGFR 的异位表达减轻了肝内脂质积累并降低了血清甘油三酯和胆固醇［38］。ESR1 是代谢过程的配体激活转录调节因子，其主要功能包括调节脂质代谢、胆汁酸稳态、能量消耗和肝炎［39］。SIRT1 现通常被认为是不同组织中的代谢调节因子，其参与脂质代谢过程，主要涉及脂肪酸合成、氧化和脂肪生成，故其缺乏可导致代谢紊乱［40］。STAT3 是一种细胞质信号转录因子，属于Janus 激酶（JAK）信号转导器和转录激活剂（STAT）途径，在介导肝损伤的过程中起着至关重要的作用［41］。线粒体作为能量代谢的工厂，在各种疾病产生的过程中起关键作用，而ALB、AKT1、PPARG、VEGFA、EGFR、ESR1、SIRT1、STAT3等基因也已被证实对线粒体能量代谢具有调控作用，而TNF、IL6 作为经典炎症因子参与NAFLD 进程，故提出其干预NAFLD 可能是通过影响线粒体能量代谢进而调控脂质代谢及减轻炎症。

GO 功能富集分析也显示苓桂术甘汤干预非酒精性脂肪肝病主要涉及激酶结合、转录因子结合、核受体活动、细胞膜筏、膜微域、转录调节复合体、泛素蛋白连接酶结合、蛋白质结构域特异性结合及泛素样蛋白连接酶结合。而KEGG 通路分析结果表明其主要涉及癌症、脂质和动脉粥样硬化、糖尿病心肌病相关信号通路，及PI3K-AKT 信号通路、胰岛素抵抗、AGE-RAGE 信号通路。在分子对接验证中，苓桂术甘汤前二十有效活性成分（如：Shinpterocarpin、Kanzonol W、Phaseollinisoflavan、3'-Hydroxy-4'-O-methylglabridin 等活性成分）与10个 靶 点（ALB、TNF、IL6、AKT1、PPARG、VEGFA、EGFR、ESR1、SIRT1、STAT3）均有良好的结合作用，表明二者可通过相互作用进而干预非酒精性脂肪肝病进程。

综上所述，通过NAFLD 大鼠模型、网络药理学及分子对接技术对苓桂术甘汤干预NAFLD 的机制进行深入研究，研究结果表明苓桂术甘汤可能通过影响线粒体能量代谢进而调节脂质代谢紊乱、减轻肝细胞炎症损伤进而干预NAFLD 进程，为深入研究苓桂术甘汤干预NAFLD 提供了研究思路。

作者贡献度说明：

赵传志：文章整体设计、撰写及相关实验；丁慧敏：数据收集及部分实验；胡紫晴：数据收集及部分实验；都永勤；数据收集及部分实验；周兰：数据收集及部分实验；周鹏：指导文章撰写；王靓：论文整体质量把控并定稿。

所有作者声明不存在利益冲突关系。