鳖甲煎丸调控miR-140 对肝癌干细胞致瘤性及干性的影响

谭钦文，徐 健，朱荣火，杜沅沁，吴颖升，彭嘉敏，梁向娟，农耀斌，黄晶晶

（1.广西中医药大学研究生院，南宁 530200；2.广西中医药大学第一附属医院，南宁 530023；3.广西高发传染病中西医结合转化医学重点实验室，南宁 530023）

肝癌是全球面临的重大健康挑战。据统计，截至2020 年，在全球癌症死亡率占比中，肝癌死亡率为8.3%，是癌症相关死亡的第四大原因[1]。早期肝癌主要治疗手段为手术切除、TACE、消融以及肝移植等，中晚期则是以放化疗为主，结合手术及对症支持治疗[2]。随着手术方式及化疗药物的不断革新，肝癌患者的生存率及生活质量得到一定的改善，但治疗后复发、转移以及药物的耐药性仍是需要迫切解决的问题。

microRNA（miRNA）是一种小型非编码RNA，其表达与细胞分化、增殖和凋亡等功能息息相关。研究发现[3]，microRNA 140（miR-140）属于抑癌基因，在肝癌组织中被发现是一种下调的miRNA。肿瘤干细胞具有自我更新以及产生出具有有限分裂和分化能力的肿瘤细胞[4]。肝癌是由多种细胞组成，其中也包括肝癌干细胞。鳖甲煎丸出自东汉医家张仲景所著《金匮要略》，即有活血化瘀、解毒散结、益气养血之功，也具备寒热并用、攻补兼施的特点。前期研究发现[5]，鳖甲煎丸所具有的 “祛瘀”及“扶正”等功效，能通利脉道，改善肝脏微环境，为干细胞归巢以及归巢后提供良好环境。基于此，项目组提出鳖甲煎丸可能通过上调miR-140 的表达，抑制肝癌干细胞的增殖，从而发挥抗肿瘤的作用。进一步探索中医药对肝癌的复发率、转移率以及耐药性的积极影响。

1 实验材料

1.1 细胞株 人肝癌细胞珠（Huh7）购自iCell（中国上海）。

1.2 实验用药 项目组采用鳖甲煎丸中成药（武汉中联药业集团股份有限公司，产品批号：202760），鳖甲煎丸：鳖甲、乌扇、黄芩、柴胡、鼠妇、干姜、大黄、芍药、桂枝、葶苈子、石苇、厚朴 、牡丹皮、瞿麦、紫葳、半夏、人参、土鳖虫、阿胶、蜂窠、赤硝、蜣螂、桃仁 。

1.3 实验动物 原有雄性BALB/c 裸鼠20 只，在种植皮下瘤体时死亡8只，现存活12只，体质量（18±2）g，由Charles River Labs（北京，中国）提供。实验均按照《机构动物护理与使用委员会（IACUC）指南》进行，并经广西中医药大学伦理委员会审核批准（审查证书编号：DW20170528-39）。

1.4 主要试剂及仪器

1.4.1 主要试剂 流式FITC anti-human CD24 抗体（货号：311103，Biolegend），流式APC anti-human CD133抗体（货号：372805，Biolegend），BCA 蛋白质浓度测定试剂盒（货号：AS1086，ASPEN），磷酸化蛋白酶抑制剂（货号：AS1008，ASPEN），RIPA 总蛋白裂解液（货号：AS1004，ASPEN），CD133 抗体（货号：66666-1-Ig，三鹰），CD24 抗体（货号：18330-1-AP，三鹰），EpCAM 抗体（货号：21050-1-AP，三鹰），AFP 抗体（货号：14550-1-AP，三鹰），蛋白Marker（货号：26616，Thermo），EntiLink™ 1st Strand cDNA（货号：EQ003，ELK Biotechnology），EnTurbo™ SYBR Green PCR SuperMix（货号：EQ001，ELK Biotechnology）。

1.4.2 主要仪器 包埋机（型号：JB-L5，武汉俊杰电子有限公司），脱水机（型号：JK-12J /JT-12P，武汉俊杰电子有限公司），病理切片机（型号：RM2016，上海徕卡仪器有限公司），台式离心机（型号：TGL-16c，上海安亭科学仪器厂），荧光定量PCR 仪（型号：QuantStudio 6 Flex System，Life Technologies），酶标仪（型号：DR-200Bs，Diatek 公司）。

2 实验方法

2.1 肝癌干细胞培养及分选

2.1.1 肝癌干细胞的培养 将Huh7 细胞在37℃下添加10%胎牛血清（FBS）的高糖DMEM 培养基和F12培养基中培养并分装。

2.1.2 肝癌干细胞的分选 收集5×106个细胞，转移到FACS BD 管中，每管2 mL。然后在每根试管中加入80 μL FACS 分选缓冲液进行细胞悬浮，加入20 μL Fc R 块缓冲液孵育10 min。细胞在4℃下与荧光抗体孵育30 min，然后在2 mL FACS 分选缓冲液中洗涤。加入2 mL FACS 分选缓冲液后，在流式细胞仪（BD，CA，USA）中进行细胞分选。

2.2 实验动物分组及给药 给药前处理：将鳖甲煎丸中成药研磨成粉，称取44 g 鳖甲煎丸溶于400 mL 生理盐水中，配置成0.11 g/mL，4℃保存备用。BALB/c 裸鼠12 只分为4 组，A 组和B 组分别先予肝癌干细胞皮下成瘤，第3周时予鳖甲煎丸或生理盐水灌胃，即A组：肝癌干细胞皮下成瘤+生理盐水灌胃，B 组：肝癌干细胞皮下成瘤+鳖甲煎丸灌胃（2.2 mg/kg/d，为成人剂量2 倍，每日1 次，共2 周）。C 组和D 组分别先予miR-140 过表达或干扰慢病毒干细胞，然后皮下成瘤，第3 周时予鳖甲煎丸或生理盐水灌胃，即C 组：miR-140 过表达慢病毒肝癌干细胞皮下成瘤+生理盐水灌胃，D 组：miR-140 干扰慢病毒肝癌干细胞皮下成瘤+鳖甲煎丸灌胃（2.2 mg/kg/d，为成人剂量2 倍，每日1 次，共2 周）。灌药时间及给药剂量参考文献[6-7]执行。

2.3 裸鼠皮下成瘤 BALB/c小鼠皮肤用酒精消毒后，右侧腋下皮下注射100 μL 的肝癌干细胞悬液，每天观察小鼠的生存状态，如精神，食欲等。到第5 周后，处死小鼠，取出瘤体组织，并测量其体积大小。肿瘤体积计算方法，肿瘤体积计算公式为：长径×短径的平方/2。

2.4 观察瘤体组织病理学变化 将用组织4%多聚甲醛固定24 h，按程序经酒精、二甲苯和石蜡之后，进行脱水浸蜡。石蜡包埋组织连续切成厚度为2 ～3 μm的切片。用苏木精和伊红对切片进行染色。在光学显微镜下观察组织形态学。

2.5 检测肝癌组织中miR-140 及CD133、CD24、EpCAM、AFP 的mRNA 水平 按照试剂盒说明书的方法。RT-PCR 检测，引物设计，EpCAM：正义5-GTG TGTGAACACTGCTGGGGT-3，反义5-CTGAAGTGCA GTCCGCAAACT-3，扩增产物大小为151bp。AFP：正义5-AGGCTGTACTCATCATTAAACT -3，反义5-ATAT TGTCCTGGCA TTTCG-3，扩增产物大小为294 bp。GAPDH：正义5-CATCATCCCTGCCTCTACTGG-3，反义5-GTGGGTGTCGCTGTTGAAGTC-3，扩增产物大小为259bp。CD133：正义5-GCACTCTATACCAAAGC GTCAAG-3，反义5-GCACGATGCCACTTTCTCAC-3，扩增产物大小为227bp。CD24：正义5-ACCCACGCAGAT TTATTCCAG-3，反义5-CACGAAGAGACTGGCTGTT GAC-3，扩增产物大小为153 bp。miR-140：正义5-GG GTAGAACCACGGCTCAAC-3，反义5-CTCAACTGGT GTCGTGGAGTC-3。U6：正义5-CTCGCTTCGGCAGC ACAT-3， 反 义5-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3。使用Trizol TRIpure 总RNA 提取试剂从组织中提取总RNA。EntiLink™应用于第一链cDNA 合成试剂盒进 行cDNA 逆 转 录。用EnTurbo™SYBR Green PCR SuperMix 试剂盒对合成的基因进行扩增。检测CD24、CD133 和EpCAM、GAPDH、miR-140 的基因表达。GAPDH、U6 则作为内部对照。用2-ΔΔCT法测定基因的相对表达量。

2.6 检测肝癌组织中miR-140 及CD133、CD24、EpCAM、AFP 的蛋白水平 使用RIPA 总蛋白裂解缓冲液从肝组织中提取蛋白质裂解物。用BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定。蛋白样品用10%SDS-PAGE 分离，转移到PVDF 膜上。然后，将转膜完成后的膜加入封闭液，在室温下封闭1 h。除去封闭液，加入一抗稀释液，将稀释好的一抗4℃过夜。随后回收已稀释的一抗，并用TBST 洗，反复3 次，每次5 min。

2.7 统计学方法 使用SPSS 25.0 软件。数据表示形式：正态计量资料以均数加减标准差（±s）表示，非正态计资料“以中位数和四分位数（P25，P75）”表示计量资料，先行正态分布检验，如各组数据全部服从正态分布，用单因素方差分析，否则用Kruskal-Wallis 非参数检验。多组间均值比较采用单因素方差分析，先行Levene Statistic方差齐性检验。方差齐性采用F 检验进行总均值比较，LSD 检验进行两两比较，方差不齐改用克鲁斯卡尔-沃利斯单因素分析ANOVA检验进行两两比较。

3 结果

3.1 流式分选肝癌干细胞 Huh7 细胞培养8 天后形成大球体（见图1）。经流式细胞分选术分选出球形细胞和Huh7 细胞表面标志物CD133 和CD24，并测得其在球形细胞中表达率为40.3%（见图2A）以及Huh7细胞中小于5%（见图2B，图2C）。

图1 肝癌干细胞成球（×100）

图2 流式细胞术检测

3.2 鳖甲煎丸及miR-140 不同表达对裸鼠瘤体体积的影响 根据测量及计算结果，A 组的平均瘤体体积大于B 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。C 组平均瘤体体积小于A 组（P＜0.05），D 组平均瘤体体积大于B 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。各组间数值对比见表1。实验中的裸鼠肿瘤图片见图3。

表1 裸鼠瘤体平均体积记录（± s）

表1 裸鼠瘤体平均体积记录（± s）

注：A 为干细胞成瘤+生理盐水灌胃组，B 为干细胞成瘤+鳖甲煎丸灌胃，C 为miR-140 过表达慢病毒干细胞+生理盐水灌胃组，D 为miR-140 干扰慢病毒干细胞+鳖甲煎丸灌胃组。与A 组比较，# P ＜0.05；与B 组比较，△P ＜0.05

组别 体积/cm3 A 0.99±0.20 B 0.47±0.49#0.40±0.11#D 0.89±0.18△C

图3 实验室中裸鼠瘤体图片（×1）

3.3 苏木精-伊红（HE）染色结果 将取皮下的瘤组织作常规石蜡切片，进行肝组织病理学观察。项目组发现为各组均可见弥漫成片的肿瘤细胞，间质较少，肿瘤细胞多呈圆形，核大，染色质粗，深染，核浆比高，可见核分裂。表明肝癌干细胞皮下成瘤形成，肿瘤细胞呈恶性。见图4。

图4 苏木精-伊红（HE）染色（×200）

3.4 鳖甲煎丸对瘤体中CD133、CD24、EpCAM、AFP 的mRNA 表达及miR-140 表达的影响 对瘤体组织进行PCR 检测，在CD133、CD24、EpCAM、AFP的mRNA 表达上，A 组显著高于B 组（P＜0.01），A 组 显 著 高 于C 组（P＜0.01）。B 组 的CD24、EpCAM、AFP的mRNA的表达均低于D组（P＜0.05）。在miR-140 的mRNA 表达上，B 组miR-140 的基因表达显著高于A 组。见表2。

表2 CD133、CD24、EpCAM、AFP、EpCAM、miR-140 的基因表达（± s）

表2 CD133、CD24、EpCAM、AFP、EpCAM、miR-140 的基因表达（± s）

注：组别详情同表1，与A 组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01；与B 组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

组别 CD133 CD24 EpCAM AFP miR-140 A 1.07±0.07 1.02±0.07 1.21±0.22 1.02±0.07 1.10±0.35 B 0.50±0.06## 0.50±0.05## 0.61±0.06## 0.50±0.05## 6.05±0.80##0.16±0.55## 0.21±0.04## 0.33±0.03## 0.21±0.04## 14.48±1.15##D 0.65±0.95 0.66±0.05△ 0.84±0.06△ 0.66±0.05△ 2.82±0.40△C

3.5 鳖甲煎丸对瘤体中CD133、CD24、EpCAM、AFP的蛋白表达相对含量的影响 对瘤体组织进行Western Bolt 检测，在CD133、CD24、EpCAM、AFP 的蛋白表达上，A组高于B组（P＜0.05），A组高于C组（P＜0.05）。而B 组CD24、EpCAM、AFP 的蛋白表达均低于D 组（P＜0.05）。见表3 及图5。

表3 CD133、CD24、EpCAM、AFP 的蛋白表达相对含量（± s）

表3 CD133、CD24、EpCAM、AFP 的蛋白表达相对含量（± s）

注：组别详情同表2，与A 组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01；与B 组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

组别 CD133 CD24 EpCAM AFP A 0.377±0.11 0.756±0.09 0.850±0.03 0.606±0.03 B 0.105±0.05# 0.233±0.02## 0.345±0.04## 0.133±0.02##C 0.066±0.02# 0.083±0.01## 0.147±0.05## 0.050±0.02##D 0.197±0.06 0.494±0.05△△0.513±0.05△ 0.285±0.03△△

图5 CD133、CD24、EpCAM、AFP 的蛋白表达相对含量

4 讨论

肝癌病机为寒热错杂，虚实夹杂，早期以邪实为主，后期以正虚为主，兼有邪实。多项研究[8-9]表明，中医药对肝癌细胞增殖、自噬、凋亡等均具有积极的作用，从而对肝癌复发和转移产生影响。鳖甲煎丸出自《金匮要略》，全方共由23 味中药组成，具有寒热并用，攻补兼施，益气养血、活血化瘀、解毒散结的功效。在古代常用于治疗癥瘕、疟母等疾病。研究[10-11]表明，鳖甲煎丸具有改善肝癌局部微环境，降低血管通透性，调节血管生成以及逆转肝癌细胞上皮间质转化等多项作用，从而抑制肿瘤的发生发展。肿瘤干细胞假说提出，肿瘤的形成与生长是由肿瘤中少量的肿瘤干细胞推动的，这些干细胞具有自我更新、全能或多能分化、致瘤能力等特性。这些未分化的细胞使肿瘤组织具有较强的再生能力及耐药性。肝脏是一个具有强大再生能力的器官，这种能力与肝脏干细胞密切相关。当肝脏受到损害时，肝干细胞不对称分裂失控而过度增生或产生基因突变，形成肝癌干细胞[12]。目前，尚未发现有药物能精准消除LCSCs，大部分治疗只对分化的癌细胞起作用，而中医药具有多靶点、多途径、多系统的特点，在预防肝癌复发方面有着积极的作用。因此，项目组积极探索中医药对肿瘤干细胞的作用，寻求靶向LCSCs 的治疗方案。

miRNA 被发现在多种癌症中处于表达下调的状态，其异常表达与许多癌症的发生和进展有关，其中也包括肝癌。研究发现，miR140-5P 是肝癌中的一个抑癌基因，也是肝癌预后的重要生物标志物[13]。瘤体体积是实验中直观反映肿瘤生长情况的一个指标。因此，在本实验中，通过比较裸鼠皮下瘤体大小，项目组发现鳖甲煎丸灌胃组裸鼠瘤体平均体积明显小于生理盐水灌胃组。miR-140 过表达慢病毒肝癌干细胞皮下成瘤+生理盐水灌胃组裸鼠的平均瘤体体积小于肝癌干细胞皮下成瘤+生理盐水灌胃组。而miR-140 干扰慢病毒肝癌干细胞皮下成瘤+鳖甲煎丸灌胃组小鼠的平均瘤体体积小于肝癌干细胞皮下成瘤+鳖甲煎丸灌胃组。说明鳖甲煎丸灌胃以及上调miR-140 的表达均能抑制裸鼠皮下瘤体生长，而当miR-140 的表达被抑制时，即使予鳖甲煎丸灌胃，但其瘤体体积依然大于单纯予鳖甲煎丸灌胃。因此，进一步推断鳖甲煎丸对裸鼠皮下瘤体的生长具有抑制作用，其作用可能与miR-140 的表达上调有关。

目前，肝癌干细胞尚未找到特异性表面标志物，但最常用的表面标志物有CD133、CD44、CD24 以及EpCAM 等。这些表面标志物表达的高低通常与肝癌干细胞干性的强弱相关。CD133 作为LCSC 标记物的作用已在多种癌症组织中得到证实。从Huh7、SMMC-7721、HepG2、Huh78 等肝癌细胞株中分离得到的CD133+细胞比CD133-细胞具有更强的集落形成能力、增殖活性以及致瘤性[14]。CD24 在肝癌干细胞中具有较强的表达，且其表达高低与肝癌干细胞样细胞的自我更新强弱呈正相关[15]。EpCAM 是LCSCs 最具代表性的标志物，EpCAM 高表达的细胞表现出干细胞样特征，包括自我更新和分化、高侵袭性以及致瘤性[16]。AFP 是胎儿肝脏中合成的一种胚胎蛋白质，随着胎儿的年龄增大，肝脏也逐渐发育成熟，AFP 逐渐接近成人水平。当肝细胞癌变、增生或受损时，AFP 分泌增加，部分肝细胞恢复产生AFP的功能，使血清AFP水平升高，AFP 可作为诊断肝癌的重要指标[17]。因此，在本研究中，根据肝癌干细胞常用的表面标志物分选出表型表达较强的细胞，种植于裸鼠皮下2 周后，便可见瘤体生长，进一步验证CD133、CD44、CD24 以及EpCAM 这些表面标志物在肝癌干细胞鉴定中的重要作用。为了进一步测定鳖甲煎丸对肝癌组织中的LCSCs干性的影响，对各组瘤体组织中CD133、CD24、EpCAM、AFP 的基因表达和蛋白表达进行测定，同时，对 miR-140 的基因表达进行了测定，并进行多组间比较。在对肝癌组织CD133、CD24、EpCAM、AFP 的mRNA 及蛋白表达的测定中，项目组发现鳖甲煎丸灌胃组明显小于生理盐水灌胃组，说明鳖甲煎丸对LCSCs干性有一定的抑制作用。因此，进一步推断鳖甲煎丸能抑制LCSCs 的增殖与侵袭能力。在随后对miR-140 的基因表达测定中，项目组发现鳖甲煎丸灌胃组miR-140 的表达明显大于生理盐水灌胃组，进一步验证了鳖甲煎丸抑制肝癌干细胞干性的表达可能与促进miR-140 的表达有关。

综上所述，本研究初步探索了鳖甲煎丸对LCSCs致瘤性具有抑制作用。同时，鳖甲煎丸降低LCSCs 表面标志物及AFP 的表达，抑制了LCSCs 的增殖、侵袭活动，从而间接推断鳖甲煎丸对肝癌的生长、复发、转移可能具有干预效果，其作用机制可能与上调miR-140 的表达有关。