基于单细胞RNA测序及生物信息学分析AFAP1L1在胃癌中的临床意义

柯帅屹 王鸿泰 沈凯誉 刘俊杰 吕建辉 高文仓

1.浙江省仙居县人民医院内科，浙江仙居 317399；2.浙江省仙居县人民医院普外科，浙江仙居 317399；3.浙江中医药大学第二临床医学院，浙江杭州 310053；4.浙江中医药大学嘉兴学院联合培养，浙江嘉兴 314001；5.浙江中医药大学附属第二医院肿瘤科，浙江杭州 310005

胃癌（gastric cancer，GC）是世界上第四大常见 癌症，也是癌症病死的第二大原因[1]，其发病机制复杂[2]。GC确诊时多为中晚期，常规治疗手段无法改善低生存率[3]。化疗作为晚期GC的主要治疗手段，以氟尿嘧啶类药物为基础，联合铂类和卡培他滨类组成两药或三药为一线治疗[4-5]，但患者中位总生存期仍然较短。生物标志物对GC的诊断和治疗具有重要的指导作用[6-8]。

肌动蛋白丝相关蛋白（actin filament associated protein，AFAP）家族的成员包括AFAP1、AFAP1相似 蛋 白1（actin filament-associated protein 1 like 1，AFAP1L1）和AFAP1相似蛋白2（actin filamentassociated protein 1 like 2，AFAP1L2）。通过形成蛋白质-蛋白质/脂质复合物参与调控肿瘤进展，AFAP家族成员作为肿瘤预后相关标志物成为可能[9]。其中，AFAP1L1已被发现在多种肿瘤中具有促癌作用[9-11]。然而在GC中的预后价值仍不清楚。本研究基于癌症基因组图谱（the cancer genome atlas，TCGA）数据库和基因表达综合（gene expression omnibus，GEO）数据库中的传统测序和单细胞RNA测序（single-cell RNA sequence，scRNA-seq）数据探索了AFAP1L1在GC中的临床意义。

1 材料与方法

1.1 数据获取

从TCGA数据库下载GC转录组、临床数据。从GEO数据库的GSE27342、GSE54129、GSE65801、GSE79973和GSE167297获取转录组和scRNA-seq数据。

1.2 方法

1.2.1 AFAP1L1表达分析 在TCGA和GEO队列中检测了AFAP1L1在GC和正常胃组织中的差异表达水平和诊断价值，并探索AFAP1L1和各临床特征之间的关系。

1.2.2 AFAP1L1的预后意义 GEPIA数据库和单、多因素Cox分析AFAP1L1对GC生存预后的影响。

1.2.3 AFAP1L1相关信号通路富集分析 按照AFAP1L1的表达中位值将GC样本分为高、低AFAP1L1两组，并以|log2（fold-change）≥1|和错误发现率＜0.05为标准筛选差异基因并进行富集分析。

1.2.4 药物敏感性预测 基于癌症药物敏感性基因组学研究数据库探索AFAP1L1表达与不同抗肿瘤药物反应之间的关系。

1.2.5 scRNA-seq分析 使用“Seurat”包创建了分析对象，＜10个细胞中表达的基因和表达＞200个基因的细胞。线粒体基因比例＜15%的细胞样本用于后续分析。主成分分析，非线性降维聚类用于识别细胞标记基因。“SingleR”包用于细胞簇的注释。

1.3 统计学方法

使用R 4.1.0软件进行数据处理。采用Kruskal-Wallis检验来评估临床病理参数与AFAP1L1表达水平之间的关系。采用Kaplan-Meier方法、数秩检验和Cox回归分析进行生存分析。两组之间比较采用秩和检验。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AFAP1L1在GC组织中过表达

对TCGA队列的分析表明，AFAP1L1在GC组织中表达程度显著高于正常胃组织样本，差异有统计学意义（P＜ 0.05）（图1a）。这与GEO数据集结果一致（图1b）。受试者工作特征曲线表明AFAP1L1具有良好诊断价值（图1c）。此外，AFAP1L1上调与不良临床表型（分级、分期及肿瘤浸润深度）相关（图2）。

图1 AFAP1L1在GC中的表达

图2 AFAP1L1与不同临床特征的关系

2.2 AFAP1L1的表达与GC患者预后的关系

生存分析显示AFAP1L1基因的低表达提示预后良好（P＜ 0.05）（图3a）。单、多Cox回归分析显示，高AFAP1L1表达预示高风险[HR=1.539（1.143～2.072），P=0.004]（图3b），且AFAP1L1是 独 立 危 险 因 素[HR=1.387（1.022～1.881），P=0.035]（图3c）。AFAP1L1-列线图显示了良好预测效能（图3d～e）。

图3 AFAP1L1的预测价值

2.3 基因富集分析预测AFAP1L1的功能

在高、低AFAP1L1表达GC患者中（图4），富集分析结果提示AFAP1L1相关差异表达基因参与血管生成的调控、上皮细胞增殖活性，与磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信号通路、焦点粘连等通路相关（图5a～b）。

图4 高、低AFAP1L1组中的差异基因

图5 功能富集分析

2.4 AFAP1L1与药物敏感性的关系

本研究探讨AFAP1L1与部分抗肿瘤药物半最大抑制浓度的关系。AFAP1L1高表达分组对达沙替尼、福瑞替尼和帕唑帕尼的敏感性较高，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。而对吉西他滨、甲氨蝶呤和替吡法尼的敏感性较差，差异有统计学意义（P＜ 0.05）（图6）。

图6 高、低AFAP1L1组中与不同抗肿瘤药物敏感性的关系

2.5 单细胞RNA测序数据的分析

在GC和癌旁组织的scRNA-seq数据中，筛选得到19 766个高质量细胞，这些细胞被聚类为19个亚群（图7a）。本研究对细胞的来源进行可视化（图7b），并最终将它们注释为B细胞、T细胞、巨噬细胞、间充质细胞、上皮细胞、内皮细胞和浆细胞（图7c）。AFAP1L1主要表达于GC组织来源的细胞，而癌旁胃组织中无明显表达（图7d），且AFAP1L1主要表达于内皮细胞（图7e）。

图7 AFAP1L1在单细胞水平的表达

3 讨论

AFAP家族成员与肿瘤的进展密切相关。AFAP1具有肌动蛋白丝衔接蛋白的功能，参与癌症细胞生长、侵袭等过程[11-12]。AFAP110发挥衔接肌动蛋白丝作用[13]。其控制蛋白激酶Ca介导的原癌基因C的激活[14]。AFAP1L2上调参与GC的曲妥珠单抗耐药[15]。AFAP1L1的异常表达促进梭形细胞肉瘤和结肠癌的不良预后[10，16]，但在GC中的表达情况仍不清楚。

本研究发现AFAP1L1在GC组织中显著过表达，且与不良临床特征和低生存率相关。本研究构建的AFAP1L1-列线图显示了良好的预测效能。此外AFAP1L1高表达GC患者对达沙替尼、福瑞替尼和帕唑帕尼等药物敏感性较强。这可能为GC的精准治疗提供新的策略。

scRNA-seq数据验证了AFAP1L1在GC组织中的表达，进一步分析发现AFAP1L1主要表达于GC相关血管内皮细胞，这验证了先前富集分析中AFAP1L1可能参与血管生成调控的结果。

综上所述，AFAP1L1在GC中表达升高且与不良预后相关，有望成为GC潜在的诊断和治疗靶点。然而，本研究基于公共数据库对AFAP1L1展开分析，因此存在一定的局限性，其生物学机制有待未来在临床与基础实验中得到证明，此外，AFAP1L1在蛋白组层面的功能有待进一步探索。