基于网络药理学探讨赤芍抗肿瘤转移的作用机制

费庆林 罗 琴 张 阳 韩 立

南阳理工学院张仲景国医国药学院 河南省张仲景方药与免疫调节重点实验室,河南南阳 473004

近年来，全球肿瘤发病率不断增长。研究表明，癌症的发病率随年龄的增长而增加[1]。癌症患者病死大多由肿瘤细胞转移所导致[2]，肿瘤细胞转移是人类在攻克癌症的过程中所要面临的巨大挑战，研究肿瘤细胞转移的相关机制和靶点有助于找到更有效的治疗方法。赤芍是一味清热凉血药，味苦性微寒，归肝经，是我国常用的传统中药材[3]。历代医籍文献中均记载赤芍，赤芍具有清热凉血、活血化瘀之功效，其含有芍药内酯苷、芍药醇、有机酸等成分，有广泛的药理作用[4]。赤芍抑制肿瘤生长的调控机制引发了研究者的广泛关注，研究证实赤芍具有非常好的抗肿瘤作用[5]。

网络药理学能够通过网络对目标进行整体性、系统性的分析，融合药理学、生物信息学等多门学科的内容和方法，因其可以对多成分、多靶点进行系统性地分析[6]，已被广泛应用于中药的科学研究中。通过网络药理学的研究方法从系统生物学的角度来探讨赤芍的活性成分及作用靶点、信号通路和疾病通路之间的关联性，解释赤芍抗肿瘤细胞转移的作用机制，为进一步深入研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 赤芍活性成分及其靶点的获取

在中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）数据库中筛选赤芍的活性成分。设定其口服生物利用度≥30%，药物相似性≥0.18[7]，下载对应化合物的结构文件并用OpenBable软件转换成MOL2格式。将文件上传至PharmMapper数据库[8]，进行靶标垂钓。获得药物各活性成分对应的靶点后，设定规范拟合度＞0.9，剔除不符合条件的数据。将药物靶点数据上传至UniPort数据库[9]进行基因名称转换。

1.2 肿瘤转移的相关靶点

分别在在线人类孟德尔遗传（online Mendelian inheritance in man，OMIM）和GeneCards数据库中，以“tumor and metastasis”为关键词进行检索，获取2个数据库中肿瘤转移疾病相关数据[10]，合并去重后得到肿瘤转移疾病相关靶点。

1.3 赤芍抗肿瘤转移潜在靶点的获取

分别将药物和疾病的靶点上传至Venny 2.1.0网站中，绘制韦恩图[11]，获取赤芍抗肿瘤转移的潜在靶点。

1.4 药物活性成分-潜在靶点网络的构建

将赤芍活性成分-潜在靶点进行整理，并导入CytoScape 3.9.0软件中，进行可视化网络的构建。进行节点连接度的计算[12]，选出排名前五位的活性成分作为赤芍抗肿瘤转移的核心成分。

1.5 靶点蛋白质互作（protein-protein interaction，PPI）网络的构建

将潜在靶点上传至STRING数据库，进行PPI分析[13]，将最低交互分数更改为最高置信度（0.900），置信度越高则所得的交互结果越可信。隐藏网络中未参与链接的节点，下载蛋白互作网络的TSV格式并导入至CytoScape 3.9.0软件[14]，进行最大集团中心度（maximal clique centrality，MCC）分析。MCC是关键节点的拓扑特征值之一，在PPI网络预测必需蛋白质的精度上具有更好的性能，MCC值越大，表明该点在拓扑结构中越重要[11]。选取MCC值排名前五位的靶点作为核心靶点进行后续的在线分子对接。

1.6 基因本体（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

将1.3中的潜在靶点上传至DIVID数据库[15]，分别进行GO生物过程（biological process，BP）、细胞组成（cell component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和KEGG富集分析[16]。将富集分析的结果，按照P值由小到大进行排列，选取各分析中排名前十位的数据进行整理，并上传至微生信网站[17]中，绘制气泡图。

1.7 分子对接

分别将选取的核心靶点与核心成分上传至SWISS DOCK在线分子对接网站（http://www.swissdock.ch/），进行分子对接。下载对接结果的压缩文件并解压，用USCF Chimera软件将对接结果进行可视化处理。

2 结果

2.1 赤芍活性成分及其靶点的获取

共获得赤芍有效成分119个，符合筛选条件的活性成分为29个。将PharmMapper数据库中获得的靶点数据进行筛选后，共得到1122个相关靶点，将得到的靶点上传至UniPort数据库中进行校准去重后，共得到132个相关靶点。

2.2 肿瘤转移的相关靶点

在GeneCards和OMIM数据库中分别获得10 276和200个疾病靶点，合并去重后共得到10 299个与肿瘤转移疾病相关的靶点。

2.3 赤芍抗肿瘤转移潜在靶点的获取

通过Venny 2.1.0网站分析，得到赤芍与肿瘤转移相关的靶点115个，即赤芍抗肿瘤转移疾病的潜在靶点。见图1。

图1 药物化学成分与疾病靶点交集图

2.4 药物活性成分-潜在靶点网络的构建

药物活性成分-潜在靶点网络图中共有144个节点，其中有效成分和潜在靶点相互作用关系有971条边，筛选出的药物核心成分为异芍药苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷、4-乙基芍药苷、4-邻甲基芍药苷。见图2。

2.5 PPI网络的构建

PPI网络总共包括78个点、158条边，大于平均自由度的有22个。MCC值排名前五位的靶点分别为SRC、HSP90AA1、MAPK1、ESR1、AKT1，认为这些靶点可能是赤芍抗肿瘤转移的核心靶点。圆形直径越大则说明该靶点评分越高。见图3。

图3 赤芍与肿瘤转移交集靶点的PPI网络图

2.6 GO和KEGG分析

共得到GO富集结果499条，其中BP 339条、CC 51条、MF 109条，得到KEGG富集结果120条。根据P值从小到大排列进行气泡图的绘制。在气泡图中气泡越大则说明该条目涉及的基因数目越多。由研究结果分析可知KEGG主要涉及癌症信号通路、脂质和动脉粥样硬化、前列腺癌等信号通路。见图4～5。

图4 GO富集分析

图5 KEGG分析

2.7 分子对接

所选的核心成分为异芍药苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷、4-乙基芍药苷、4-邻甲基芍药苷，核心靶点为SRC、HSP90AA1、MAPK1、ESR1、EGFR。受体与配体结合形成稳定构象时的能量越低，则说明两者结合的可能性越大，从对接的结果上来看它们的分子结合能均＜-7 kcal/mol，这表明药物核心成分与疾病核心靶点具有很好的结合活性。见表1、图6。

表1 核心成分与核心靶点结合能

图6 核心成分与核心靶点的分子对接图

3 讨论

近年来多项研究表明赤芍具有抗肿瘤的作用[5，18-20]。马云飞等[5]分析发现芍药苷可通过抑制人乳腺MDAMB-231和MCF-7细胞中的Notch-1信号通路，进而抑制细胞的侵袭性。吴杨峥[18]研究发现4-乙基芍药苷能够明显地抑制人的口腔表皮样癌κB细胞的增殖，且随4-乙基芍药苷浓度的增加，抑制作用增强。陈志伟等[19]以S180肉瘤小鼠为研究对象，发现赤芍总苷对肿瘤细胞有抑制增殖、诱导分化、促进凋亡的作用。赤芍总苷可以使线粒体膜电位降低，增加细胞液中细胞色素C和第二线粒体激活因子的含量，抑制肿瘤细胞增殖、分化和诱导细胞凋亡[20]。

选取的核心靶点是肿瘤转移疾病中的重要靶点。当SRC蛋白表达升高时，会使E-钙粘蛋白的表达降低，进而导致细胞间的黏附能力减弱，使细胞的迁移与侵袭能力发生改变[21]。MAPK1过表达可激活MAPK1/ERK2信号通路，促进肿瘤细胞的侵袭与迁移[22]。HSP90AA1在肿瘤中的表达水平上升，在临床上和胃癌患者具有一定的相关性；HSP90AA1能促进胃恶性肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭以及上皮间质转化[23]。ESR1属于核激素受体家族的成员，能够参与靶细胞的增殖、分化与稳态。孙嘉慧等[24]通过对人乳腺癌细胞MCF-7进行基因敲除后进行细胞侵袭等实验，证实了ESR1低表达能够明显提高乳腺癌细胞侵袭能力。在肿瘤患者中，EGFR呈阳性高表达时，可激活磷脂酰肌醇3-激酶蛋白激酶B和细胞外信号调节激酶信号通路，进而促进肿瘤细胞的增殖和分化，使肿瘤侵袭和转移的风险提高，进而影响临床治疗效果[25]。

综上所述，本研究通过网络药理学和分子对接的方法，初步阐述了赤芍抗肿瘤转移的作用机制，通过对具有多成分、多靶点特点的赤芍与肿瘤转移复杂网络关系的研究，阐述了赤芍抗肿瘤转移的有效成分、关键靶点以及所涉及的生物过程和通路，使“药物-靶点”网络可视化，为进一步研究赤芍抗肿瘤转移提供了部分参考和理论依据。