改良Videman法构建兔膝骨关节炎模型的探索

罗娆珊 唐青梅 龚 广 余立志 罗三彤 梁伟明

广西科技大学第一附属医院，广西柳州 545000

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是多种因素引起的退行性疾病，以关节软骨退化变性、软骨增生、骨赘形成和软骨下骨硬化为主要病理特征；以关节疼痛、关节活动障碍为主要临床表现[1-2]。任何年龄段均可发病，但以中老年多见，多发于活动负重过度或承重失衡的关节，随着我国老龄化人口的增加，发病率也随之增高[3]。KOA尚无彻底治愈的方法，其发病机制也尚未完全阐明。因此，积极探索KOA发病机制和防治措施，开发新治疗技术、方法，对提高临床疗效具有重要的作用[4]。制作稳定的、符合疾病发展规律的KOA动物模型是保证成功开展KOA研究的关键环节[5]。

研究人类KOA发病机制、治疗策略时，经常会使用KOA动物模型。关节制动是KOA动物造模的常用方法之一，它是通过各种方法固定关节，使关节应力发生改变，从而造成关节损伤[6]。经典的Videman造模法通过伸直位固定建立KOA模型，是关节制动造模法的一种[7]。本研究参考经典的Videman造模法，经过一定的改良，探索出一种膝关节伸直位夹板固定法构建兔KOA模型，并从多个方面对兔KOA模型进行综合评价，为构建KOA动物模型提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂、仪器

健康新西兰兔12只，雄性，体重2.5～3.0 kg，由湖南太平生物科技有限公司提供，许可证号：SCXK（湘）2020-0005。室温条件下分组饲养，自由饮食，本研究经广西科技大学第一附属医院（本院）医学伦理委员会审查批准（伦理审批号：2023-DW023）。10%甲醛、10%硝酸、番红O软骨染色液（北京索莱宝科技有限公司），兔子饲养架、兔专用固定盒、医用夹板、卡扣自锁式尼龙塑料扎带，RM2235型轮转式切片机（德国Leica公司），BX53型正置荧光生物显微镜（日本Olympus公司）。

1.2 动物分组

健康雄性新西兰兔按照随机数表法分为对照组、模型组，每组各6只。对照组：室温正常饲养，不做任何处理；模型组：室温正常饲养1周后，使用医用夹板将兔右膝关节伸直位固定，每次固定60 min，每天2次，持续4周。

1.3 造模方法

选取并裁剪宽、长合适的医用夹板。将兔的右下肢膝关节完全伸直，使用一层医用棉垫包裹右下肢防止皮肤压伤。在右下肢前、后、内、外四周各放置一块医用夹板，夹板近端靠近大腿根部，远端靠近小腿远端。用5根卡扣自锁式尼龙塑料扎带均匀捆绑4块医用夹板并扣紧，将右下肢膝关节固定在伸直位。足部及脚趾端露出以便于观察血流是否通畅，防止缺血性坏死。固定后将兔放入兔专用固定盒，防止兔剧烈挣扎或啃咬导致医用夹板松动。固定60 min后拆卸医用夹板，每天上午、下午各操作1次，共计4周。

1.4 测量及观察指标

1.4.1 行为学评估 造模结束后，将每只兔子分别放于水平地板上自由活动，参照Lequesne MG评分标准[8]分别对兔子的局部疼痛、步态改变、关节活动、关节肿胀情况进行观察并记录、评分。

1.4.2 取材及膝关节标本大体形态观察 行为学评估结束后，采用空气栓塞法处死两组兔子，剪开皮肤、分离肌肉，充分暴露膝关节软骨，截断并取膝关节标本。观察并记录膝关节大体形态、膝关节间隙及软骨的改变。取胫骨、股骨端，放入体积分数为10%的甲醛溶液中固定12 h，经固定后的标本，放入10%硝酸脱钙48 h，以矢状面将胫骨、股骨端（包含软骨下骨）分别切取4块骨组织（每块厚2 mm）做石蜡包埋。

1.4.3 作病理切片及改良Mankin’s关节软骨病理评分 取每一块骨组织石蜡标本于石蜡切片机上连续切取3 μm厚的矢状切面，每隔5张取两张制片做番红O染色，每一块骨组织石蜡标本制片1～2张，在光镜下对软骨各层结构进行观察并记录。每张切片选取3个不同视野，参照改良Mankin’s关节软骨病理评分标准[9]，对软骨结构、软骨细胞、基质染色及潮线完整性进行评分并统计。番红O染色：骨组织切片常规脱蜡、水化，放入软骨染色液（番红O法）内侵染1～2 min，蒸馏水洗1 min；分别用95%乙醇、无水乙醇脱水；二甲苯透明，中性树脂封片。

1.5 统计学处理

采用SPSS 26.0统计学软件处理数据，不符合正态分布的计量资料用[M（P25，P75）]表示，采用秩和检验。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组兔子行为学Lequesne MG评分比较

对照组无局部疼痛，无关节肿胀，步态、关节活动均处于正常状态，各项评分为0；模型组患肢步态不正常，触碰突然收缩、关节活动障碍、有轻度肿胀、骨性标志模糊，综合得分为[2.00（0.00，8.00）]分，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见表1。

表1 两组兔子行为学Lequesne MG评分比较[分，M（P25，P75）]

2.2 两组兔子膝关节标本形态观察比较

对两组膝关节标本行肉眼观察，对照组大体标本无明显肿大，软骨结构正常，表面光滑；模型组肿大明显，关节腔隙变窄，软骨部分磨损，表面质地粗糙，见图1。

图1 两组大体标本比较

2.3 两组兔子番红O染色及改良Mankin’s关节软骨病理评分比较

如图2所示，对照组软骨表层平整光滑，软骨细胞形态、大小、数量正常，分布均匀，排列整齐，软骨4层细胞结构清晰可见，由浅到深各层细胞呈逐渐增大，基质染色正常，潮线完整；模型组软骨表层不平整，软骨明显增生，软骨细胞增加且簇集，细胞形态、大小呈多样性、细胞排列不规则，全层软骨组织结构紊乱，基质染色减少，潮线不完整。根据改良Mankin’s关节软骨病理评分标准对两组分别进行评分并统计。对照组各项评分为0，模型组各项评分均高于对照组，其中模型组综合得分为[3.00（0.00，7.50）]分，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见表2。

表2 两组兔子改良Mankin’s关节软骨病理评分比较[分，M（P25，P75）]

图2 两组兔子番红O染色膝关节软骨病理形态学比较（400×）

3 讨论

哺乳动物的关节、半月板、韧带和软骨在相对尺寸上与人类相似，但不同的实验动物有不同的优点和缺点[10]。兔子易饲养、易获取，建模操作方便，膝关节软骨薄，适合早期骨关节炎模型的研究。本研究选择兔子探索一种简便、易控的KOA动物造模方法，旨在为KOA的病理研究创造基础。KOA动物模型分为自发模型、手术模型和非手术模型[11]。关节制动法是非手术KOA动物造模法的常用方法之一，其中最经典的关节制动法是Videman造模法。

本研究预实验采用Videman法构建兔KOA模型，用管型石膏固定兔膝关节于伸直位，但兔子活动过程中石膏容易脱落，最终造模失败。后经改良，使用医用夹板替代管型石膏，卡扣自锁式尼龙塑料扎带来替代绷带，操作更为简便、牢靠、省时。将固定膝关节于伸直位的兔子，置于兔专用固定盒，避免兔子剧烈活动致使医用夹板固定不牢，进而提高造模成功率。改良Videman法构建KOA模型也存在不足之处，兔膝关节固定后对肢体造成肿胀、僵硬，骨性突起部位、下肢皮肤等容易压伤，兔子啃咬固定部位，致固定不牢靠等情况也会有发生，无法避免。

易强等[12]的研究结果显示，与正常组比较悬吊组Lequesne MG评分均显著升高（P＜ 0.01），悬吊组膝关节软骨大体观察可见典型的软骨破坏符合膝骨关节炎病理学改变，悬吊组Mankin’s评分均显著升高（P＜ 0.01），达到轻中度骨关节炎的评分等级。李东东等[13]的研究结果表明，与假手术组相比模型组动物行走困难，膝关节软骨组织损伤严重，局部软骨面缺损，软骨细胞排列紊乱，软骨细胞数量减少，部分软骨层丢失，缺失区域存在纤维组织增生情况，Lequesne MG评分、Mankin评分高于假手术组，经骨痹散治疗后评分均降低，且差异有统计学意义（P＜ 0.05）。张劲等[14]的研究显示，新型组、传统组均可见关节囊明显增厚，关节液黄色浑浊，关节软骨呈灰黄色，表面凹凸不平，部分有坏死脱落。姜铃霞等[15]在观察实验性软骨损伤（实验性骨关节炎）病理分期的结果表明，造模术后第2、4、8、12、16、20周Mankin’s评分均比对照组（术前）高，且术前为0.33分，术后20周得分最高13.00分。

本研究持续造模4周后结束。研究结果显示，模型组Lequesne MG评分较对照组明显升高，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；与对照组比较，模型组膝关节肿大，关节腔隙变窄，软骨部分磨损，表面质地粗糙；番红O染色模型组呈基质染色明显减少，软骨表层不平整，软骨组织结构紊乱，软骨增生，软骨细胞增加、簇集，细胞形态多样、排列不规则等病理特征；模型组改良Mankin’s关节软骨病理评分较对照组明显升高，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。本研究虽未开展HE染色、免疫组织化学等其他病理学相关实验。但模型组膝关节形态特征、番红O染色、Lequesne MG评分及改良Mankin’s关节软骨病理评分的结果与上述研究结果一致。因此，改良Videman法构建KOA模型，使用膝关节伸直位医用夹板固定建立兔KOA模型可行，且操作简便、高效。这为构建KOA动物模型提供了参考，有利于膝骨关节炎发生发展机制以及治疗的研究，并为其提供建模依据。