自制ISCOMATRIX与CpG联合的HCA587蛋白疫苗的制备及其免疫效应评估

谭媛芳,陈惠媛,焦 薇,范秋颖,邵国青,熊祺琰,陈娟娟

(1.南昌大学第二附属医院检验科,江西省检验医学重点实验室,南昌 330006;2.江苏省农业科学院兽医研究所,农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,国家兽用生物制品工程技术研究中心,南京 210014)

肿瘤-睾丸抗原(cancer/testis antigen,CTA)仅表达在癌细胞和某些生殖细胞表面,并且在肿瘤组织中高度表达,这种限制性表达模式使其成为肿瘤疫苗的潜在靶点[1]。本课题组前期从原发性肝细胞癌患者的肿瘤组织cDNA表达文库中鉴定出一种新的CTA,即HCA587/MAEG-C2抗原,与已被广泛研究的NY-ESO-1和MAGE-A3相比,HCA587在肿瘤患者中的表达水平更高[2],并且在肿瘤患者血清中能检测到自然产生的HCA587抗体[3],提示HCA587具有良好的肿瘤组织表达特异性和免疫原性,是肿瘤疫苗设计的优质候选抗原。

寡脱氧核苷酸CpG是Toll样受体9激动剂,可促进Th1细胞活化与NK细胞增殖,诱导特异性毒性T细胞产生[4]。免疫刺激复合物基质(immune-stimulating complexes matrix,ISCOMATRIX,ISCOM)是一类以皂苷为基础制备的微粒,能协助抗原呈递,刺激与增强体液和细胞免疫应答[5],其与CpG佐剂联合使用可有效地激活Th1型免疫反应[6]。本课题组研制的HCA587蛋白疫苗中含有商品化ISCOMATRIX与CpG佐剂,在小鼠模型中显示出了显著的肿瘤预防和治疗能力[7]。然而,目前国内已无法获得商品化ISCOMATRIX,鉴于其在HCA587蛋白疫苗中重要的佐剂作用以及该疫苗的临床应用潜能,自行制备ISCOMATRIX十分必要。本研究采用透析法自制ISCOMATRIX,并比较了HCA587蛋白联合CpG和不同剂量的自制ISCOMATRIX所产生的免疫效应,旨在为后续HCA587蛋白疫苗的抗肿瘤应用研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要试剂

胆固醇、Tween-20购自北京索莱宝科技有限公司;N-癸酰基-N-甲基葡糖胺(Mega-10)购自美国Avanti Polar Lipids公司;Quil A购自赛德奥生物科技(北京)有限公司;磷脂酰胆碱购自中国食品药品检定研究院;商品化免疫刺激复合物ISCOMATRIX购自瑞典Isconova AB公司;小鼠IFN-γ酶联免疫斑点法(IFN-γ ELISpot)检测试剂盒(包含抗IFN-γ包被抗体、生物素标记抗IFN-γ抗体、亲和素标记碱性磷酸酶)购自澳大利亚MABTECH公司;5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐/氮蓝四唑(BCIP-NBT)底物显色液购自美国Sigma公司;辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗小鼠IgG抗体购于美国Promega公司;可溶性单组分TMB底物显色液购自北京天根生化科技有限公司;PBS粉剂购自武汉塞维尔生物科技有限公司。CpG ODN 1826序列:5′-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3′,委托上海生工生物工程有限公司合成。pGEX-6P-1-HCA587重组质粒的构建和HCA587重组蛋白的表达纯化委托北京中美冠科生物技术有限公司完成。

1.1.2 细胞系和实验动物

稳定表达HCA587的小鼠黑色素瘤细胞系(B16-HCA587)由本课题组自行构建,用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养。

6～8周龄的雌性C57BL/6J小鼠购自浙江维通利华实验动物技术有限公司(许可证号:SCXK(浙)2019-0001)并饲养在万级屏障环境中。本研究方案经南昌乐悠生物科技有限公司动物福利伦理委员会批准(RYE2022092501和RYE2022111801)。

1.2 实验方法

1.2.1 ISCOMATRIX的制备

ISCOMATRIX自制过程详见文献[8],简要步骤如下:1)用蒸馏水和Mega-10干粉制备20% Mega-10溶液,后加入磷脂酰胆碱与胆固醇,制成1%脂类混合物贮备液;2)取200 μL 1%脂类混合物贮备液与1300 μL无菌磷酸盐缓冲液(PBS)混匀,加入2% Quil A贮备液500 μL,充分混匀后冰浴超声处理。转移至透析袋对无菌PBS透析去除洗涤剂Mega-10,最后过滤除菌备用(Quil A终浓度为0.5%);3)取100 μL进行磷钨酸负染,电镜观察。

用PBS稀释上述制备完成的ISCOMATRIX,使Quil A浓度为1 mg·mL-1(0.1%)。在100 μL的 HCA587蛋白(10 μg)结合CpG(12 μg)配以QuilA浓度为0.005%(5 μg)、0.012%(12 μg)、0.018%(18 μg)和0.036%(36 μg)自制ISCOMATRIX的疫苗溶液体系中,分别加入5、12、18、36 μLQuilA浓度为0.1%的自制ISCOMATRIX。

1.2.2 小鼠免疫模型的建立

将小鼠随机分为7组,每组6只。实验组分别给予HCA587(10 μg)结合CpG(12 μg)配以不同剂量自制ISCOMATRIX(5、12、18、36 μg)或商品化ISCOM制剂(12 μg)。对照组给予PBS溶液或CpG+36 μg自制ISCOMATRIX佐剂溶液。各组均于第0、21天进行尾根部皮下注射,注射体积为100 μL·只-1,于第35天收获小鼠脾脏及血清。

具体免疫分组:A组,HCA587+CpG+5 μg ISCOM;B组,HCA587+CpG+12 μg ISCOM;C组,HCA587+CpG+18 μg ISCOM;D组,HCA587+CpG+36 μg ISCOM;E组,HCA587+CpG+12 μg 商品化ISCOM;F组,PBS;G组,CpG+36 μg ISCOM。其中A-D组为自制ISCOMATRIX实验组,E组为商品化ISCOM实验组,F组和G组分别为PBS缓冲液对照组和佐剂对照组。

1.2.3 小鼠脾细胞刺激和IFN-γ ELISpot实验

充分研磨各组小鼠脾脏并裂解红细胞,用含10%胎牛血清的1640培养基重悬脾细胞。在预包被抗小鼠IFN-γ单抗的96孔平底硝酸纤维素板中,每孔加入5×105个脾细胞,A-G组各有9个样孔,包括3个实验孔,3个培养基对照孔和3个卵清蛋白(OVA)-1对照孔。实验孔每孔加入100 μL 2.5 μg·mL-1HCA587重组蛋白,培养基和OVA对照孔中分别加入等体积的完全培养基和2.5 μg·mL-1OVA溶液,在37 ℃下孵育20 h。用PBST(含0.05% Tween-20)洗板后加入生物素标记的抗小鼠IFN-γ单抗,在37 ℃下孵育2 h。加入碱性磷酸酶标记的链霉亲和素,室温下避光孵育1 h。洗板后加入BCIP-NBT显色液避光显色,用自来水冲洗终止反应。待反应板晾干后,统计每孔的斑点数。

1.2.4 小鼠血清HCA587抗体酶联免疫吸附实验

用1 μg·mL-1HCA587重组蛋白溶液包被培养板,4 ℃孵育过夜,洗板后加入2%牛血清白蛋白(BSA)封闭,洗涤。加入100 μL不同稀释倍数的各组小鼠血清,在37 ℃下孵育2 h。洗板后加入HRP标记的抗小鼠IgG抗体,在37 ℃下孵育90 min。洗板后加入TMB显色液室温反应3～5 min,每孔加入100 μL 2 mol·L-1H2SO4溶液终止反应。测定各孔450 nm处的吸光度(OD值),OD值大于或等于PBS对照组血清孔的平均OD值的2.1倍的样孔为阳性。

1.2.5 小鼠肿瘤治疗模型的建立

将治疗模型小鼠分为HCA587蛋白疫苗治疗组和PBS对照组。第0天,在2组每只小鼠右侧胁腹部皮下接种1×104个(100 μL)B16-HCA587细胞;分别在第7、28天,给HCA587蛋白疫苗治疗组小鼠尾根部皮下注射100 μL HCA587蛋白疫苗,含CpG和最佳剂量的自制ISCOMATRIX,并给PBS对照组小鼠尾根部皮下注射等体积的无菌PBS溶液。

每周用游标卡尺测量肿瘤的大小2～3次,计算肿瘤体积:肿瘤体积=长径×短径2×0.52。第35天处死小鼠,无菌操作下获取各组小鼠肿瘤组织。

1.3 统计学方法

使用GraphPad Prism9软件对实验数据进行统计分析并作图。采用单因素方差分析(One-way ANOVA)比较组间分泌IFN-γ的脾细胞频数与血清HCA587抗体ELISA OD值;采用非配对t检验比较组间肿瘤体积大小。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 自制ISCOMATRIX微观结构表征

自制ISCOMATRIX经磷钨酸负染后的电镜照片见图1(封三)。自制ISCOMATRIX具有典型的蜂窝笼状结构,大小均一,直径为20～30 nm。

A:比例尺200 nm;B:比例尺100 nm。图1 电镜下ISCOMATRIX的微观结构

2.2 以自制ISCOMATRIX为佐剂的HCA587蛋白疫苗的免疫效果

2.2.1 细胞免疫效果

小鼠脾细胞刺激和IFN-γ ELISpot实验结果显示,E组(阳性对照)分泌IFN-γ脾细胞频数显著高于F组(阴性对照)(349.70±134.10比8.33±3.06,P<0.000 1)。使用不同浓度自制ISCOMATRIX制备的HCA587蛋白疫苗都能在小鼠体内诱导HCA587抗原特异性的细胞免疫应答,其中以12 μg 自制ISCOMATRIX(B组)和36 μg自制ISCOMATRIX(D组)联合CpG制备的疫苗应答较强,2组分泌IFN-γ的脾细胞频数与E组相比,差异无统计学意义(280.00±39.00、291.70±78.39比349.70±134.1,均P>0.05),并显著高于F组和G组(280.00±39.00、291.70±78.39比3.67±1.16、8.33±3.06,均P<0.000 1);而5 μg(A组)、18 μg(C组)自制ISCOMATRIX联合CpG制备的疫苗免疫的小鼠分泌IFN-γ的脾细胞频数虽高于F、G组(211.00±2.00、105.00±5.57比3.67±1.16、8.33±3.06,P<0.0001),但低于E组(211.00±2.00、105.00±5.57比349.70±134.10,P=0.004)。见图2(封三)。

A:显示实际斑点数的ELISpot板图;B:各组疫苗诱导的HCA587抗原特异性脾细胞分泌IFN-γ的频数。*P<0.001,**P<0.000 1与E组比较。

2.2.2 体液免疫效果

HCA587抗体ELISA结果显示,E组(阳性对照)1×104倍稀释血清中HCA587抗体阳性,其450 nm处OD值为0.95±0.13,是F组(0.24±0.05)的4.02倍。B组、C组和D组1×104倍稀释血清HCA587抗体亦阳性(450 nm处OD值分别为F组的5.36、3.72和3.33倍),诱导产生的血清HCA587抗体水平均较高,450 nm处OD值与E组相比,差异无统计学意义(1.26±0.33、0.88±0.48和0.79±0.54比0.95±0.13,P>0.05);与PBS对照组相比,仅12 μg自制ISCOMATRIX组的抗体滴度在一万倍稀释时显示统计学优势(1.26±0.33比0.24±0.05,P=0.006 2)。见图3(封三)。

稀释倍数稀释倍数

综合各组疫苗的ELISpot和ELISA结果,HCA587蛋白联合12 μg、36 μg自制ISCOMATRIX诱导小鼠产生HCA587的细胞和体液免疫应答效果最显著,并且未观察到佐剂对小鼠的毒性作用。在能够产生有效免疫应答的前提下,选取剂量较小的佐剂浓度(即Quil A浓度为0.012%的自制ISCOMATRIX)进行后续肿瘤治疗实验。

2.3 以自制ISCOMATRIX为佐剂的HCA587蛋白疫苗的肿瘤治疗效果

与PBS对照组相比,HCA587蛋白疫苗治疗组小鼠肿瘤生长显著减慢,第35天时,HCA587蛋白疫苗治疗组小鼠肿瘤尺寸显著小于PBS对照组[(1 528.0±373.3)mm3比(2 699.0±417.4)mm3,P=0.018 1]。见图4(封三)。

肿瘤生长曲线。*P<0.05与PBS对照组比较。图4 以自制ISCOMATRIX为佐剂的HCA587蛋白疫苗的肿瘤治疗效果

3 讨论

肿瘤的主动免疫治疗,例如肿瘤疫苗,旨在通过输送靶向抗原来诱导机体产生特异性体液免疫和/或细胞免疫应答,以直接杀伤肿瘤细胞或破坏肿瘤生长的微环境,从而抑制肿瘤的恶性进展。然而,在实际应用中,初次免疫时,如果疫苗不含佐剂,可能导致免疫原性不足[9]。佐剂是一类能够增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型的物质[10]。在疫苗中引入佐剂不仅可以改变适应性反应的程度和质量,还能使先天免疫发挥作用,从而提供对特定病原体的最大保护[11]。因此,佐剂的应用能够激发肿瘤疫苗的预防和治疗潜力。

ISCOMATRIX是一种基于皂苷的佐剂,其应用潜力引起了学界的广泛关注。ISCOMATRIX通过纳米颗粒形式控制了皂苷的毒性,同时保留了其强大的免疫原性。ISCOMATRIX有两种主要形式:经典的ISCOMTM和ISCOMATRIXTM,前者由皂苷、胆固醇、磷脂和抗原混合而成,而后者则不包含抗原。经典的ISCOM疫苗需要在与皂苷、胆固醇和磷脂形成的结构中添加两亲性蛋白(如膜蛋白),这限制了可以用于制备ISCOM疫苗的蛋白类型,并且制备过程复杂,难以控制和复制[5,12]。相比之下,ISCOMATRIXTM佐剂的制备工程更加简单,几乎可以与任何抗原配制,其活性成分皂苷可以从多种天然植物中提取,来源丰富且安全无毒,表现出强有力的佐剂活性[13-16]。因此,ISCOMATRIXTM佐剂更广泛地用于肿瘤疫苗的制备和开发。

ISCOMATRIX佐剂表现出卓越的抗原呈递和免疫刺激功能。在接受ISCOMATRIX疫苗后,抗原主要由树突状细胞接受并进行交叉呈递,进入MHC Ⅰ类分子提呈途径,从而启动淋巴结和脾组织中免疫细胞的募集[17-18],这对于诱导激活杀伤性T细胞反应至关重要。有研究[19]证实,ISCOMATRIX佐剂能够诱导均衡的Th1/Th2应答,并且在禽偏肺病毒(aMPV)灭活疫苗中,含有ISCOMATRIX的疫苗可促进鸡脾组织中IFN-γ和IL-4的表达,增强B细胞和T细胞的免疫活性,为感染宿主提供长期针对MPV/B的保护。此外,Ⅱ期临床试验[20]结果表明,黑色素瘤患者接受含有ISCOMATRIX的重组NY-ESO-1蛋白疫苗后产生强烈的免疫反应,包括NY-ESO-1特异性CD4+和CD8+T细胞以及抗体水平显著增加,这降低了黑色素瘤完全切除后的复发风险。值得注意的是,ISCOMATRIX佐剂制备的H1299细胞裂解疫苗不仅增强了对CT抗原的免疫应答,还能够调节外周免疫亚群,减少调节性T细胞(Tregs)和单核细胞上PD-1的表达,从而促进免疫活性环境[21],表明ISCOMATRIX佐剂可抵抗肿瘤诱导的全身性免疫抑制。肿瘤浸润的CD8+T细胞随着肿瘤的进展而逐渐耗竭,抗肿瘤能力减弱,但ISCOMATRIX佐剂与Toll样受体3激动剂、多肌苷多胞酸(Poly I:C)以及Flt3L、FMS样酪氨酸激酶3配体的治疗性癌症疫苗联合应用似乎能够扭转这一困境,该联合佐剂疫苗策略能够通过激活NK细胞和CD4+T细胞介导抗肿瘤作用,从而实现了肿瘤的消退[22]。ISCOMATRIX佐剂明显促进了NK细胞的增殖和功能激活,这在其他佐剂的作用中并未观察到,而在免疫原性较弱的肿瘤治疗中,NK细胞具有重要作用。ISCOMATRIX佐剂也增强了CD4+T细胞的应答,维持抗肿瘤免疫记忆。此外,ISCOMATRIX佐剂与其他佐剂联合应用时,可发挥更强大的抗肿瘤效应,因为不同类型的佐剂具有不同的作用机制,能够通过同时激活多种免疫细胞和机制来诱导互补或协同的免疫应答,从而获得比单一佐剂更强大的抗肿瘤免疫效应[23]。

本课题组自行制备ISCOMATRIX佐剂已取得了初步成功[8],采用透析法制备的自制ISCOMATRIX纳米颗粒的特性与之前的研究[24]结果一致。ISCOMATRIX的主要成分Quil A具有一定的溶血性和毒性,根据小鼠毒性实验[25]的结果,疫苗中Quil A的安全剂量范围为5～25 μg·只-1,当剂量达到30～50 μg·只-1时,小鼠开始出现毒性反应,包括精神萎靡、行动迟缓和被毛逆立等症状,但并不致死,剂量为50 μg·只-1时小鼠出现溶血等严重不良反应并可导致死亡。因此本研究使用了5、12、18和36 μg的Quil A剂量并探索其对小鼠的免疫活性,以筛选既安全又具有高免疫效力的自制ISCOMATRIX剂量。结果显示,即使在最大剂量(36 μg Quil A)下,小鼠也没有出现不良症状,表明本研究自制ISCOMATRIX佐剂在最大剂量以下是安全可用的。在本课题组早期已经成功使用商业化ISCOMATRIX联合CpG制备了HCA587蛋白疫苗,这种疫苗显著诱导了小鼠高水平的HCA587特异性免疫反应[26]。在本研究结果表明,12和36 μg的自制ISCOMATRIX与HCA587蛋白疫苗联合可刺激小鼠产生强烈免疫应答,导致脾细胞中分泌IFN-γ的频数显著增加,与商品化ISCOMATRIX联合的效果一致。尽管肿瘤疫苗的抗肿瘤效应主要由细胞免疫介导,但体液免疫应答的协同抗瘤作用也十分重要[27]。ELISA实验结果显示,12、18和36 μg 的自制ISCOMATRIX与商业化ISCOMATRIX诱导的抗HCA587抗体滴度相当,甚至在1×104倍稀释时稍显优势,说明自制的ISCOMATRIX佐剂能够有效地将传递抗原信息给B细胞,激发体液免疫应答。ELISpot和ELISA的结果确定了12 μg 为自制ISCOMATRIX作为HCA587蛋白疫苗联合佐剂的最佳剂量。在黑色素瘤小鼠模型中,自制ISCOMATRIX联合HCA587蛋白疫苗能够显著抑制肿瘤的生长,表现出的抗肿瘤能力与商业化ISCOMATRIX联合HCA587蛋白疫苗相当[7]。此前研究[7,28]也表明,HCA587蛋白疫苗能够增强荷瘤小鼠的IFN-γ+CD4+T细胞免疫应答,降低肿瘤局部Tregs水平,减少其中血管生成,自制ISCOMATRIX将使对HCA587蛋白疫苗抗肿瘤机制的进一步的研究变得更加便利。

NY-ESO-1/ISCOMATRIX肿瘤疫苗治疗晚期黑色素瘤的临床试验[29]显示,肿瘤疫苗的治疗效果与肿瘤内Treg细胞数量密切相关。一些肿瘤疫苗会诱导晚期黑色素瘤患者体内特异性Treg扩增,导致肿瘤免疫受到抑制,这也是单纯使用ISCOMATRIX疫苗治疗难以使肿瘤消退的一个重要原因[30]。而ISCOMATRIX疫苗与靶向消除Treg的免疫制剂(如TLR3/9激动剂和环磷酰胺)的联合治疗策略在对抗Treg介导的免疫逃逸或耐药性肿瘤中表现出了卓越的抗肿瘤能力。此类联合治疗策略不仅能够诱导抗原特异性的细胞和体液免疫应答,还能够阻止Treg在肿瘤内发挥免疫抑制作用,最终导致肿瘤生长受到强烈的阻遏[31-34]。基于自制ISCOMATRIX佐剂制备的HCA587蛋白疫苗显著减缓了黑色素瘤的生长,该疫苗有望与其他免疫制剂联合使用,为晚期黑色素瘤患者提供了新的治疗手段。

然而,本研究存在一些不足之处。一方面,Quil A作为ISCOMATRIX佐剂的重要成分,其有效剂量是根据Quil A浓度梯度来确定的,但这并不能代表实际制备有效佐剂所需的最佳剂量,构建有效的佐剂往往需要更大量的皂苷[35]。另一方面,本研究采用透析法制备ISCOMATRIX佐剂,在制备过程中透析时间较长,洗涤剂(Mega-10)的浓度是决定透析时间的关键因素。为了更短的时间内充分去除洗涤剂,可考虑选择更大体积的透析袋/管,或采用分袋/管透析,以增大透析液的表面积与体积比[36]。

综上所述,本课题组自制ISCOMATRIX联合CpG组成的HCA587蛋白疫苗能显著诱导小鼠产生HCA587特异性的细胞与体液免疫应答,且能在小鼠体内发挥显著的肿瘤治疗作用。