hRNF6基因重组质粒的构建及蛋白表达和定位

李洋，刘彤，李丹妮，李丰

（中国医科大学 1.基础医学院细胞生物教研室，教育部细胞生物学重点实验室；2.94期临床医学，沈阳 110001）

hRNF6基因重组质粒的构建及蛋白表达和定位

李洋1，刘彤1，李丹妮2，李丰1

（中国医科大学 1.基础医学院细胞生物教研室，教育部细胞生物学重点实验室；2.94期临床医学，沈阳 110001）

目的 构建环指蛋白6（RNF6）真核表达载体，并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位。方法 提取工具细胞HEK-293的mRNA，反转录为cDNA。PCR扩增hRNF6全长编码基因，并将其克隆至pCDNA3.1-myc-his A及pEGFP-C1表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到工具细胞HEK-293中，提取细胞蛋白进行Western blot检测。利用共聚焦激光扫描显微镜观察pEGFP-RNF6在工具细胞CV-1和胃癌SGC-7901细胞内的定位。结果hRNF6全长基因序列克隆到了真核表达载体pCDNA3.1-myc-his A和pEGFP-C1中，酶切鉴定片段为2058bp。Western blot检测到了融合蛋白表达，分子量约为78kDa。pEGFP-RNF6在CV-1细胞和胃癌SGC-7901细胞内定位以细胞核为主，在细胞质内少量表达。结论 成功的构建了hRNF6全长基因真核表达载体，pEGFP-RNF6蛋白主要定位于胃癌细胞核内。

环指蛋白6；基因克隆；融合蛋白；转染；胃癌

靶蛋白的水解作用是细胞调节的一种重要机制，错误折叠的或者与内环境不相适应的靶蛋白将被细胞降解［1］。泛素蛋白酶系统为充分降解靶蛋白提供了一种有效的途径。蛋白质泛素化作用是由一系列的酶参与完成的多步化反应：它包括泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶（ubiquitin-ligase，E3）［2］。在大多数情况下，E3参与底物的识别，在调节泛素与底物连接的特异性上起着中心作用［3，4］。环指蛋白（ring finger protein，RNF）是一类含有环指基的锌指蛋白，是最大的E3家族，与E2泛素结合酶相结合，可促进靶蛋白的降解，在蛋白质降解代谢中作为蛋白质特异性降解的泛素蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system，UPS）参与了细胞内许多重要的生理生化过程［5］。UPS在肿瘤中的重要作用也逐渐被人们所认识。因此，本研究构建了人RNF6基因cDNA全长的真核表达载体，并证实了其融合蛋白在细胞内的表达及定位，为进一步探讨胃癌信号通路中RNF6的生物学功能奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒和细胞

大肠杆菌DH5α为本实验室制备；真核表达载体pEGFP-C1购于Clontech公司，pcDNA3.1-myc-his A购于Invitrogen公司；胃癌细胞系SGC-7901及工具细胞HEK-293、CV-1为本实验室保存。

1.2 主要试剂

PryobestTMDNApolymerase，dNTP，凝胶回收试剂盒，反转录试剂，限制性核酸内切酶购自大连TaKaRa公司；TRIzol RNA提取试剂购自Invitrogen公司；T4DNA连接酶购自NEB公司；anti-myc抗体购自Santa Cruz公司；引物合成、DNA序列测定由上海生物工程有限公司完成；ECL发光试剂盒购自Pharmacia公司。

1.3 HEK-293总RNA提取及反转录

用含10%胎牛血清的DMEM培养HEK-293细胞至90%融合，提取细胞总RNA。在3.5cm直径的培养板中加入1ml TRIzol，用移液器反复吹打，直到细胞全部裂解。按照说明书进行RNA提取后，按照TaKaRa反转录试剂盒说明书进行操作。

1.4 hRNF6全长基因的扩增

设计hRNF6扩增的PCR引物，并在引物序列中分别加入KpnⅠ、XhoⅠ和EcoRⅠ、XhoⅠ限制性酶切位点。以HEK-293cDNA为模板，进行PCR扩增hRNF6全长编码序列。扩增的条件为95℃5min预变性；95℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 2min，此 3个温度进行30个循环；最后72℃10min。

1.5 pCDNA3.1-myc-hisA-hRNF6表达载体的构建

将pCDNA3.1-myc-hisA载体和hRNF6PCR片段分别用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，同时将pEGFPC1载体和hRNF6PCR片段分别用KpnⅠ和XhoⅠ双酶切，37℃反应过夜，凝胶回收纯化产物。将2个片段用T4DNALigase于16℃连接过夜后转化E.coliDH5α感受态菌，37℃过夜扩培。用碱裂解法提取质粒DNA，用双酶切鉴定外源基因的插入，进行测序分析。

1.6 hRNF6真核表达载体瞬时转染

用DMEM高糖培养基培养HEK-293细胞，用DMEM培养基培养SGC-7901细胞，细胞铺于6孔板至70%～80%融合，按照Invitrogen公司提供的Lipofectamine2000转染6孔板的说明书进行转染操作。

1.7 Western blot鉴定

转染48h后，弃培养基，用PBS清洗细胞2遍。收集细胞后加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，裂解细胞。4℃13000g离心30min，取上清5μl进行蛋白定量。取80μg总蛋白经10%SDSPAGE凝胶分离，4℃过夜恒压转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭3h，TBST洗膜15min，3次。用anti-myc抗体（1∶500稀释）孵育，TBST洗膜15min，3次。用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠（1∶5000稀释）二抗孵育1h，TBST洗膜15min，3次。ECL显色，发光。

1.8 共聚焦激光扫描显微镜观察EGFP-RNF6细胞内定位

将真核表达载体pEGFP-RNF6转染到工具细胞CV-124h后，应用OLYMPUSFV1000S-SIM/IX81激光共聚焦扫描显微镜进行扫描，激发光波长为488nm，可看到RNF6蛋白在细胞内的定位处呈现绿色。

2 结果

2.1 人RNF6基因全长PCR扩增（图1）

以HEK-293cDNA为模板，特异性引物进行聚合酶链反应扩增hRNF6全长。1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明扩增出与预计长度相符的长度为2058bp的野生型RNF6基因编码区。

图1 PCR扩增hRNF6全长序列结果Fig.1 PCRamplification of the full lengthhRNF6

2.2 hRNF6重组真核表达质粒的构建和鉴定

将重组质粒pCDNA3.1-myc-his A-hRNF6经EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切后得到了约5.5kb和2000bp左右的两条带，将重组质粒pEGFP-hRNF6经KpnⅠ/XhoⅠ双酶切后得到了约4.8kb和2000bp左右的2条带。经过测序分析，外源序列在NCBIBlast比对结果与hRNF6编码序列一致。见图2。

2.3 真核表达质粒在HEK-293细胞中的表达

将构建的真核表达质粒pCDNA3.1-myc-his A-hRNF6转染到HEK-293细胞系中，48h后将提取的蛋白经10%SDS-PAGE凝胶电泳，Western blot检测到了融合myc-HisA-RNF6蛋白的表达。分子量约为78kDa，为质粒本身的myc-HisA标签分子量（3～4kDa）和 hRNF6的分子量（75kDa）之和，说明融合蛋白表达。见图3。

图2 重组质粒pCDNA3.1-myc-his A-RNF6和pEGFP-RNF6的酶切结果Fig.2 Restriction enzyme disgestion of the recombinant plasmid pCDNA3.1-myc-his A-RNF6and pEGFP-RNF6

图3 融合蛋白myc-hRNF6的表达Fig.3 Western blot analysis of myc-HisA-hRNF6fusion protein

2.4 pEGFP-RNF6在细胞内的定位

通过共聚焦激光扫描显微镜，我们观察到pEGFP-RNF6无论在工具细胞CV1或胃癌细胞SGC-7901细胞内定位都以核为主，细胞质内仅有少量表达。见图4。

3 讨论

图4 pEGFP-RNF6在细胞内的定位Fig.4 The localization of pEGFP-RNF6in the cells

蛋白质代谢是生命体调节自身适应环境的一种重要机制，而作为蛋白质代谢中重要一环的降解代谢对生命行使的功能是不可或缺的。在蛋白质降解代谢中作为蛋白质特异性降解的泛素蛋白酶体系统（UPS）参与了细胞内许多重要的生理生化过程。RNF6就是泛素化系统中的一种E3连接酶。RNF6是环指蛋白家族中的一员，环指蛋白的重要作用是参与蛋白的泛化作用，它能将泛素转移到酶作用的底物上，然后通过蛋白酶的作用降解底物［6］。RNF6基因全长2058bp，编码685个氨基酸，包括其N端的螺旋结构域和C端的一个RING-H2指。研究表明，泛素连接酶和肿瘤的发生、发展、转移密切相关。

本实验从cDNA文库中扩增出了hRNF6的全长基因序列，并将其构建到了真核细胞表达载体pCDNA3.1-myc-his A和pEGFP中。将融合质粒转染到HEK-293细胞中，Western blot验证融合蛋白在细胞中表达。利用共聚焦激光扫描显微镜证实，pEGFP-RNF6在胃癌SGC-7901细胞内定位以细胞核为主，在细胞质内少量表达。基因全长的获得和表达以及细胞内的定位为进一步研究RNF6的生物学特性打下了基础。

［1］Timothy R，Thomas H，Zavolan M，et al.Systematic characterization of the zinc-finger-containing proteins in the mouse transcrip-tome［J］.Genome Res，2003，13（6b）：1430-1442.

［2］Sun Y.Targeting E3ubiquitin ligases for cancer therapy［J］.Cancer Biol Ther，2003，2（6）：623-629.

［3］Sullivan JA，Shirasu K，Deng XW．The diverse roles of ubiquitin and the 26Sproteasome in the life of plants［J］．Nat Rev Genet，2003，4（12）：948－958．

［4］Ulrich HD．Natural substrates of the proteasome and their recognition by the ubiquitin system［J］．Curr Top Microbiol Immunol，2002，268（1）：137-174．

［5］Potten CS，Booth C，Tudor GL，et al.Identification of a putative intestinal stem cell and early lineage marker：musashil［J］.Differentiation，2003，71（1）：28-41.

［6］Joazeiro CA，Weissman AM，Mammen J.RINGfinger protein：mediators of ubiquitin ligase activity［J］.Cell，2000，102（5）：549-552.

（编辑 王又冬，英文编辑 赵传胜）

Construction of the Recombinant Plasmid of HumanRNF6Gene and the Expression and Localization of Fusion Protein

LIYang1，LIUTong1，LIDan-ni2，LIFeng1
（1.Department of Cell Biology，College of Basic Medical Sciences，The Key Laboratory of Cell Biology of Ministry of Education of China，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.The 94th Class，Faculty of Clinical Medicine，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo construct an eukaryotic expression vector ofRNF6（ring finger protein 6）gene and identify its recombinant protein expression and localization.MethodsTotal mRNAwas extracted from HEK-293cells，cDNAwas formed by reverse transcripton.ThehRNF6coding sequence was amplified by polymerase chain reaction（PCR）method and cloned into pcDNA3.1-myc-his Avector and pEGFP-C1vector.After the target region was sequenced，the plasmid was transfected into HEK-293cell lines.The expression of the recombinant plasmid in HEK-293cells was proved by Western blot.The localization of pEGFP-RNF6in CV-1cell and gastric cancer cell SGC-7901was observed by using laser scanning confocal microscopy.ResultshRNF6had been constructed into expressing vector pCDNA3.1-myc-his Aand pEGFP-C1successfully.The length of the fragment was 2058bp，identified by restriction enzymes digestion.The expression of myc-RNF6fusion protein was detected by Western blot，with a molecular weight 78kDa.The pEGFP-RNF6protein was localized more in the nucleus，less in the cytoplasm.ConclusionThe recombinant plasmid was successfully cloned into eukaryotic expressing vector，the pEGFP-RNF6fusion protein was expressed mainly in the nucleus.

RNF6；gene cloning；fusion protein；transfection；gastric cancer

Q257

A

0258-4646（2010）12-0995-03

国家自然科学基金重大研究计划（90813038）；国家自然科学基金资助项目（30771128）

李洋（1986-），女，硕士研究生.

李丰，E-mail：fli@mail.cmu.edu.cn

2010-09-08