胰腺十二指肠同源盒 -1在乳腺癌分子亚型中的表达及临床意义

施 华,宋旭东,张晓霞,张志勇,朱海燕

对乳腺癌的治疗研究发现,对同一临床分期及病理类型的乳腺癌,采用同一治疗方案的疗效可出现明显不同。随着分子生物学技术的发展,越来越多的研究证实乳腺癌预后与许多分子标志物密切相关。2000年,Perou等[1]在总结分析前人发现的基础上,使用 cDNA微阵列研究发现了乳腺癌生物学上的差异,并提出乳腺癌的分子分型。本研究通过免疫组织化学和实时定量 PCR法探讨胰腺同源合 -1(PDX-1)与乳腺癌分子分型的关系,为临床制定乳腺癌的个体化治疗方案提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集唐山市工人医院2005年 1月—2008年 5月术中切取的石蜡和新鲜标本各 200例。患者术前未经任何治疗,标本经术中快速病理诊断均为乳腺浸润性导管癌。

1.2 主要试剂 二抗 PDX-1、雌激素受体 (ER)、孕激素受体 (PR)、第二号人类表皮生长因子受体 (Her-2)、细胞角蛋白 5＆6(CK5/6)和上皮生长因子受体 (EGFR)等免疫组化试剂购于福州迈新生物技术开发有限公司。SYBR Green PCRⅠ、Rnase酶、M-MLV反转录酶、Taq酶、Olig(dT)15引物均购自美国Promega公司,dNTP购于上海生工生物工程技术服务有限公司,PDX-1引物(上游 :5′-CTTG GGTATGGATCTGTG G-3′, 下游:5′-CGGACTCATCGTACTCCTGCTT-3′)和 β -actin引物 (上游 5′-CCATCATGAAGTGTGACGTGG-3′, 下游:5′-GTCCGCCTAGAAG CATTTGCG-3′)购自北京奥科公司。

1.3 主要方法 免疫组化采用 EnVision法,详细操作过程参照说明书。用已知阳性乳腺癌切片做阳性对照,以 PBS代替一抗做空白对照[2]。随机观察计数 10个高倍视野的 PDX-1蛋白的阳性表达细胞数,平均每高倍镜视野的阳性肿瘤细胞数≥15%即判断为阳性。其中 Her-2以≥30%的细胞膜显色为阳性。

提取组织总 RNA按照 Total RNA isolation system说明书操作。cDNA合成的反应体系为:5×Revesre trnascripaste 5.0 μl,dNTP 2.0 μl,RNasin 0.5 μl、MMLV RTase0.5μl(总体积 20μl),37℃60 m in、95℃ 5 min得到 cDNA溶液。PCR反应体系为:单链 cDNA 1μl、SYBR Green PCR I 1 μl、 10 ×PCR buffer 5μl、 PCR上游引物 1.5μl、 PCR下游引物 1.5μl、 MgCl27μl、 Taq DNA Polymerase0.5 μl、 dNTP 1 μl、 DEPC处理过的水 33μl。温度条件:94℃10min、 94℃30 s、57℃ 30 s、 72℃ 30 s共 45个循环。每个样品中 PDX-1 mRNA值以相对量表示 (N=PDX-1 Ct值 /β-actin Ct值)。

1.4 分型标准 乳腺癌分子亚型参照Nielsen分型标准[3],以免疫组化结果进行分型:(1)腺腔 A型:ER(+)/PR(+)、Her-2(-);(2)腺腔 B型:ER(+)/PR(+)、Her-2(+);(3)Her-2过表达型:ER(-)/PR(-)、Her-2(+);(4)基底细胞样型:ER、PR和 Her-2均为 (-),CK5/6和 (或)EGFR(+);(5)未分类型:ER、PR、Her-2、CK5/6、EGFR均(-)。

1.5 统计学方法 采用 SPSS 12.0统计学软件行 χ2检验和方差分析,以 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

实验结果显示 PDX-1蛋白和 mRNA在乳腺癌管腔 A型和管腔 B型中的表达显著低于 Her-2过表达型、基底细胞样型和未分类型 (P＜0.05,见表 1)。

表 1 PDX-1蛋白和 PDX-1mRNA在乳腺癌分子亚型中的表达Tab le 1 Expression of PDX-1 protein and PDX-1 mRNA in molecular subtype of breast cancer

3 讨论

随着对乳腺癌的深入研究发现,乳腺癌是一类在分子水平上具有高度异质性的疾病,传统的病理形态学诊断及分期已不适应肿瘤学研究的发展需求,从分子水平对肿瘤发生、发展的病理学机制及生物学行为进行研究已成为当前的研究方向。以肿瘤分子表达差异为基础的乳腺癌分子分型的提出将对于解决肿瘤的异质性、分期的合理性、预后判断的准确性及乳腺癌的个体化治疗提供重要的依据。因此,本实验选择在乳腺癌分子分型的基础上分析PDX-1的表达情况。

PDX-1是胰腺胚胎发育中关键的转录因子,具有调节胚胎期胰岛细胞发育、增殖、分化和成熟及 β细胞的分泌功能[3]。Tirone等[4]发现用 RIP(rat insulin promoter)/tk(thymidine kinase)转染鼠胰岛瘤 NIT-1细胞,可预防低血糖症和肿瘤生长。此后,有研究进一步证实PDX-1不仅与胰腺癌的发生有关[5-6],还可用于胰腺、胃肠及肺脏腺癌的鉴别诊断。我们前期的研究亦发现 PDX-1在乳腺癌中的表达显著高于癌旁组织和乳腺良性病变组织[7],提示 PDX-1参与乳腺癌的发生、发展。Levy等[8]对体外乳腺癌AU565细胞株的研究发现,PDX-1 mRNA在乳腺癌细胞株中表达并激活 RIP,外源性 PDX-1能提高 LacZ在 AU565中的表达。因此他们认为 RIP-TK/GCV治疗对乳腺癌细胞株有细胞毒性,外源性PDX-1提高细胞毒性。这一实验结果证明了利用肿瘤细胞某些特异抗原转录基因表达高的特点,启动药物前体转化酶激活,达到特异性杀伤肿瘤细胞的途径是可行的。本实验结果显示 PDX-1蛋白和mRNA在乳腺癌管腔型中的表达显著低于其他分子亚型,临床检测 PDX-1蛋白或mRNA的表达,有助于乳腺癌的临床病理分型。此外,乳腺癌治疗方案的选择主要取决于癌细胞 ER、PR及 Her-2的表达。其中管腔型者为雌激素和 (或)孕激素受体表达阳性,适合激素内分泌治疗。结合本实验的结果,我们推测对于 ER阴性的患者在不适宜进行内分泌治疗的情况下,可以进行针对 PDX-1的基因治疗。PDX-1在乳腺癌中的临床意义与对肠癌的研究结果[9]相似,有望成为评判乳腺癌预后、分子分型和基因治疗的参考指标。

本实验仅对 PDX-1与乳腺癌分子亚型之间的关系进行研究分析,未能全面反映 PDX-1对乳腺癌生物学行为的影响,还有待更深层次的探讨。

1 Perou CM,Sorlie T,Eisen MB,et al.Molecular portraits of human breast tumours[J].Nature,2000,406(6797):747-752.

2 Nielsen TO,Hsu FD,Jensen K,et al.Immunohistochem ica and clinical characterization of the basal-like subtype of invasive breast carcinoma[J].Clin Cancer Res,2004,10(16):5367-5374.

3 Gannon M,Ables ET,Crawford L,et al.pdx-1 function is specifically required in embryonicβcells to generate appropriate numbers of endocrine cell types and maintain glucose homeostasis[J].Dev Biol,2008,314(2):406-417.

4 Tirone TA,Fagan SP,Templeton NS,et al.Insulinoma-induced hypoglycemic death in m ice is prevented with beta cell-specific gene therapy[J].Ann Surg,2001,233(5):603-611.

5 Quint K,Stintzing S,Alinger B,et al.The expression pattern of PDX-1,SHH,Patched and G li-1 is associated with pathological and c linical features in human pancreatic cancer[J].Pancreatology,2009,9(1-2):116-126.

6 Srivastava A,Hornick JL.Immunohistochemical staining for CDX-2,PDX-1,NESP-55,and TTF-1 can help distinguish gastrointestinal carcinoid tumors from pancreatic endocrine and pulmonary carcinoid tumors[J].Am J Surg Pathol,2009,33(4):626-632.

7 施华,宋旭东,张晓霞,等 .乳腺癌组织中 PDX-1蛋白及mRNA的表达变化及意义 [J].山东医药,2009,49(42):102.

8 Levy S,Zhou B,Ballian N,et al.Cytotoxic gene therapy for human breast cancer in vitro[J].J Surg Res,2006,136(1):154-160.

9 Ballian N,Liu SH,Brunicardi FC.Transcription factor PDX-1 in human colorectal adenocarcinoma:a potential tumormarker?[J].World J Gastroenterol,2008,14(38):5823-5826.