微量生色底物法测定肝素钠抗Ⅹa因子和抗Ⅱa因子活性

李 京,范慧红

(中国药品生物制品检定所,北京 100050)

2009年1月,我们实验室参加了第6次肝素国际标准品的协作标定工作。这次国际协作标定由英国国家生物制品检定所(NIBSC)组织,用第5次肝素国际标准品对6个第6次肝素国际标准品待标品进行效价测定。传统的肝素效价测定方法为凝血法[1-3],这次协作标定鼓励参加的实验室用底物法测定肝素效价,以比较底物法与凝血法测定结果的差异,考虑是否可以用底物法取代凝血法。英国药典2009年版收载了半微量生色底物法测定低分子肝素抗Ⅹa因子和抗Ⅱa因子活性的方法[4]。但该方法需使用大量昂贵的酶反应试剂,实验效率低,不能在短时间内对多批样品同时进行检测。于是我们对实验方法进行了改进,用微量底物法测定了6个肝素待标品的活性,实验结果误差小,重复性良好。

1 仪器与试药

Spectra MAX190型酶标仪,美国Molecular Devices公司;中国药典生物检定统计程序BS2000,本所编制。

标准品(S):第五次肝素国际标准品(批号:97/578,效价:2 031 IU/支),冻干品,-20℃保存于安瓿中 ,共 4支 ,每支编号分别为S1、S2、S3、S4。

供试品(T):第六次肝素国际标准品待标品,共6 个(编号 T、V、W、X、Y、Z),冻干品,-20 ℃保存于安瓿中,每个供试品4支,分别编号,如待标品T的4 支安瓿编号分别为T1、T2、T3、T4。

发色底 物 S-2765:N-α-Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA·2HCl,相对分子质量(Mr)为714.6、发色底物S-2238:H-D-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl,M r为625.6、抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)(10 IU/瓶)、Ⅹa因子(71 nkat/支),均由意大利chromogenix公司生产;Ⅱa因子:国家标准品,批号140625-200308(供效价测定用),580 IU/支,本所制备;三羟甲基氨基甲烷(Tris)、聚乙二醇6000(PEG6000)为进口分装试剂;其他试剂为国产分析纯。

2 方 法

2.1 溶液配制

Tris缓冲液(pH 8.4):取Tris 6.06 g、氯化钠10.23 g、乙二胺四醋酸二钠(EDTA-2Na)2.8 g和PEG6000 1 g,加水900mL使溶解,用盐酸调节pH值8.4,加水稀释至1 000mL。4℃冰箱保存,备用。

发色底物S-2765溶液:用无菌水制成0.001 mol/L的溶液,4℃冰箱避光保存。

发色底物S-2238溶液:用无菌水制成0.001 25 mol/L的溶液,4℃冰箱避光保存。

ATⅢ溶液:用Tris缓冲液(pH 8.4)制成1IU/mL的溶液和0.125 IU/mL的溶液。

Ⅹa因子溶液:用Tris缓冲液(pH 8.4)制成7.1 nkat/mL的溶液。

Ⅱa因子溶液:用Tris缓冲液(pH 8.4)制成5 IU/mL的溶液。

50%醋酸溶液:冰醋酸50mL加水至100mL。

标准品和供试品溶液:标准品与供试品先以纯水溶解并稀释至约100 IU/mL,分装至1.5mL塑料离心管中,-20℃冻存。临用前取出,放置至室温后使用。复融后的样品不得再次冷冻。实验时用Tris缓冲液(pH 8.4)分别将标准品和供试品溶液稀释成在log剂量-反应的线性范围内的4个不同浓度的溶液,剂距r=1∶0.7,抗Ⅹa因子活性测定浓度范围为0.016 8～0.049 IU/mL;抗Ⅱa因子活性测定浓度范围为0.010 1～0.024 IU/mL。

2.2 抗Ⅹa因子活性测定

在96孔酶标板上加样,标准品和供试品每个浓度平行做两孔,可以同时测定3个供试品,实验时可参照表1的顺序排列。每孔分别加入4种浓度的S或T稀释液25μL,及1 IU/mL的ATⅢ溶液25μL,置于酶标仪中混匀(不得产生气泡),并在37℃保温2 min。每管加Ⅹa因子溶液50μL(可根据空白试验结果调整),混匀,37℃保温2 min,加发色底物S-2765溶液50μL,混匀,37 ℃保温2 min后,加50%醋酸溶液50μL终止反应。在405 nm波长处测定每孔的吸光度(A)值。实验前以Tris缓冲液(pH 8.4)代替T同法操作作为空白对照,可以适当调整加入的Ⅹa因子溶液的体积,使空白的A值在0.6～0.9之间。实验中,所用试剂在冰浴中保存。以A值为纵坐标,标准品或供试品溶液浓度的对数值为横坐标分别作线性回归,按生物检定统计法[1]中的量反应平行线原理4×4法完全随机或随机区组实验设计,回归关系应非常显著(P＜0.01),标准品和供试品回归直线相互平行,偏离平行不显著(P＞0.05),二次曲线、反向二次曲线不显著(P＞0.05),实验可靠性测验通过者计算效价和95%概率水平的误差范围(FL%)。

2.3 抗Ⅱa因子活性测定

除加入ATⅢ溶液浓度改为0.125 IU/mL、50 μL,Ⅹa因子溶液改为5 IU/mL Ⅱa因子溶液,发色底物改为加入S-2238溶液25μL外,实验设计、步骤及数据统计同抗Ⅹa因子测定,Ⅱa因子溶液加入的体积也可根据空白试验适当调整。

3 结果与讨论

用4 d时间分别测定了6个待标品的抗Ⅹa因子和抗Ⅱa因子效价,每个待标品测定了4支,实验顺序如表1。

表1 实验顺序Tab.1 Order of testing

6个待标品效价测定结果见表2和3。每个待标品4次测定结果的平均值以几何平均值计算,单次实验的实验误差以95%概率水平的可信限率(FL%)表示,4次测定结果误差以几何变异系数(geometric coefficient of variation,gcv)表示,gcv的计算参照文献[5]。可以看出,1次实验同时测定3批样品效价,实验数据可以通过实验可靠性检测,可信限率小于15%,4次测定的误差均小于10%,实验重复性良好。

表2 肝素待标品抗Ⅹa因子效价(IU/支)测定结果Tab.2 The results of the assay for anti-FⅩa potencies(IU/ampoule)of candidates

表3 肝素待标品抗Ⅱa效价(IU/支)测定结果Tab.3 The results of the assay for anti-FⅡa potencies(IU/ampoule)of candidates

英国药典使用的半微量生色底物法[4]反应总体积在1mL左右,反应在小管中进行,用分光光度计测定吸光度,1次反应时间约30 min,一般1次只能测定1批样品的效价。该方法实验效率低,需使用大量酶反应试剂,实验成本高。我们在该方法的基础上进行改进,将半微量生色底物法改为微量生色底物法,使反应总体积降至200μL,反应在96孔酶标板中进行,用酶标仪测定样品吸光度,1次反应时间约为10 min,1次实验可以同时测定3批样品的效价,实验结果良好。微量生色底物法使实验效率得到了很大提高,并且节省了昂贵的酶反应试剂,降低了检验成本。

酶反应实验易受反应浓度、试剂活力、环境等因素影响,降低了反应体积后,实验操作需更加小心,以减少实验误差。

在这次国际协作标定中,我们实验室还用中国药典兔全血法[1]、美国药典羊血浆法[2]、英国药典APTT法[3]测定了待标品的效价,与底物法测定的结果一起报告了NIBSC。2009年6月,我们收到NIBSC给参加实验室的协作标定报告。共有18个国家的34个实验室参加了这次协作标定,用底物法测定待标品抗Ⅹa因子和抗Ⅱa因子效价的实验室分别有24个和18个,结果分别见表2和表3,我所与NIBSC的结果基本一致。这次国际协作标定的其他情况,将另文报告。

[1]中国药典[S].二部.2005:附录102-附录103.

[2]USP[S].32.2008:2553-2554.

[3]BP[S].2008:990-991.

[4]BP[S].2008:992-993.

[5]ThomasK.Geometric means and measure of dispersion[J].Biometrics,1979,35(10):908-909.