缺氧环境对PC12细胞损伤及HIF-1 mRNA表达水平的影响

姚 娟，马慧萍，杨 燕，樊鹏程，景临林，贾正平

(1.兰州大学药学院，甘肃兰州 730000;2.兰州军区兰州总医院药材科，甘肃兰州 730050)

维持氧稳态是保证哺乳动物细胞正常生长与分化的必需条件［1］，缺氧可严重影响机体的正常生理功能，在缺氧环境下，机体出现肺水肿、缺氧性肺动脉高压［2］、氧自由基代谢紊乱、细胞钙离子超载、兴奋性氨基酸中毒、线粒体膜通透性改变等，但细胞缺氧损伤精确的机制尚未阐明。本实验利用PC12细胞建立培养细胞缺氧模型，通过观察缺氧前后细胞的形态、检测不同缺氧时间点LDH活性、HIF-1 mRNA表达水平差异，探讨了缺氧对PC12细胞的损伤作用及其初步机制，为缺氧损伤性疾病的防治提供理论依据。

1 材料

PC12细胞由兰州大学基础医学院惠赠;OLM-PUS TH4-200倒置显微镜(日本OLMPUS公司);DMEM/F-12培养基(CIBCO公司);胎牛血清(兰州民海生物工程有限公司);Thermo三气培养箱(美国Thermo公司);甲基噻唑蓝四氮唑盐(MTT，Invitrogen公司);二甲基亚砜(DMSO，美国Sigma公司);Model 550型酶标仪(美国Bio-RAD);XK96-3型微量振荡器(姜堰市新康医疗器械有限公司);RNAiso Reagent、TakaRa Prime ScriptTMreagent Kit、PCR 扩增试剂盒(大连宝生物公司);引物由宝生物工程公司合成。

2 方法

2.1PC12细胞的培养PC12细胞接种培养于含10%胎牛血清的DMEM/F-12培养液中(含有青霉素1×105IU·L-1及链霉素1×105IU·L-1)，培养在37℃、5%CO2、饱和湿度的二氧化碳培养箱，每3天换液1次。大约在培养PC12细胞铺满皿底约70% ～80%后传代。

2.2PC12细胞形态观察在倒置显微镜下观察正常培养的PC12细胞及缺氧48 h的形态变化。

2.3MTT法检测缺氧环境对PC12细胞的增殖影响将细胞悬液接种于96孔培养板，调整细胞密度至 5 ×103·L-1，每孔 200 μl，置于二氧化碳培养箱中，37℃培养，待细胞贴壁后分正常组和缺氧组，正常组细胞37℃、5%CO2、饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养 0，12，24，48 h，缺氧组细胞 37℃、95%N2+5%CO2、饱和湿度缺氧处理 0，12，24，48 h。弃培养液，PBS漂洗1次，每孔加入20 μl MTT(终浓度为0.5 g·L-1)，置于37℃、5%CO2培养箱内继续培养4 h 后，加入 DMSO 150 μl，振荡10 min，紫色结晶完全溶解后，于全自动酶标仪490 nm波长处测定OD值。以正常培养的PC12细胞作为对照，计算缺氧处理0，12，24，48 h 的抑制率，抑制率 CI/%=(1-试验组OD值/对照组OD值)×100%。抑制率为正值表示对细胞有杀伤作用，负值表示对细胞有促增殖作用。

2.4缺氧环境对PC12细胞LDH的影响乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH)能催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸与2，5-二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中呈棕红色，通过比色可求出酶活力。PC12 细胞缺氧培养 0，2，4，8，12，24 和48 h后测定各组细胞培养上清液乳酸脱氢酶的活力，以0 h作为对照组，按LDH测试盒说明操作并计算LDH活力。

2.5缺氧环境对PC12细胞HIF-1 mRNA表达水平的影响提取总RNA:PC12细胞缺氧处理0，2，4，8，12，24，48 h 后，弃培养液，PBS 漂洗2 次，加入1 ml RNAiso Reagent试剂裂解细胞，收集裂解液加入200 μl氯仿 4℃ 13 500 r·min-1离心 15 min，取上清液加入等体积的异丙醇混匀后冰上静置15 min，4℃ 13 500 r·min-1离心15 min弃上清液，75%乙醇纯化沉淀，4℃ 13 500 r·min-1离心5 min，弃上清后-80℃保存，紫外分光光度计检测浓度，并用1%甲醛变性琼脂糖电泳检测其完整性。

逆转录:使用TakaRa Prime ScriptTMreagent Kit将总RNA反转录为cDNA。逆转录体系及反应条件均参照说明书设定。

引物设计:在Genbank中查询HIF-1α、GAPDH mRNA序列，由宝生物公司根据序列设计并合成引物。GAPDH作为参照(Tab 1)。

Real-time PCR检测:按照Applied Biosystems公司7300仪器操作说明进行实验。采用20 μl反应体系，反应条件:两步法PCR扩增，条件为95℃预变性30 s;95℃反应5 s，60℃退火 31 s，40个循环。Real-time RT-PCR实验数据以0 h作为对照，采用△△Ct法处理数据［3］。

2.6统计学方法所有统计分析均采用SPSS 13.0统计软件完成，结果均以±s表示。各组的组间均数比较用方差分析。

3 结果

3.1PC12细胞形态观察正常培养的PC12细胞为贴壁细胞，呈不规则圆形，折光度强，成簇生长，Fig 1A。缺氧损伤48 h后，细胞变圆，折光度减弱，最终细胞圆缩，脱落，Fig 1B。

3.2MTT法检测缺氧环境对PC12细胞的增殖作用不同缺氧作用时间对PC12细胞有一定影响，存在时效关系。分别于0，12，24，48 h用MTT法测定其对细胞的增殖作用，缺氧12 h与对照组比较细胞活力降低(P＜0.05)，缺氧24 h与对照组比较细胞活力降低(P＜0.01)，结果见 Fig 2，Tab 1。

Fig 1 Morphology changes on PC 12 cell after hypoxia(×200)

Fig 2 Optical density(OD)of hypoxia on PC12 cells by MTT colorimetry(±s，n=6)

结果表明，缺氧环境对PC12细胞增殖有明显的抑制作用，0，12，24，48 h 4 个不同时间点，随着时间的增加，缺氧环境对PC12细胞的增殖抑制作用明显增强。

3.3缺氧环境对PC12细胞中LDH的影响乳酸脱氢酶法测定缺氧不同时间对PC12细胞损伤程度，结果见Fig 3。

Fig 3 Influence of LDH on PC12 cells by hypoxia environment(¯x ± s，n=6)

Tab 2 Cytotoxic index(CI)of hypoxia on PC12 cells by MTT colorimetry

结果表明，缺氧2，4，8，12 h后细胞培养液中的LDH活性增高，到8 h达到顶峰，与对照组相比具有差异(P＜0.01)。缺氧24 h后LDH酶的活力下降，说明缺氧环境能引起LDH释放，并有一定的时效关系。

3.4缺氧环境对PC12细胞HIF-1 mRNA表达量的影响采用Real-time RT-PCR检测缺氧环境对PC12细胞HIF-1 mRNA表达量的影响，不同缺氧作用时间对PC12细胞HIF-1 mRNA的表达量有一定影响，存在时效关系。分别在2，4，8，12 h提高HIF-1 mRNA的表达量，与对照组相比差异有显著性(P＜0.01)，缺氧4 h时HIF-1 mRNA的表达量最高。在缺氧24，48 h HIF-1 mRNA的表达量下降，结果见Fig 4。观察GAPDH和HIF-1 mRNA的溶解曲线和扩增曲线，表明二者的Real-time RT-PCR扩增为特异性扩增，见 Fig 5，6。

Fig 4 The effect of hypoxia on PC12 cell of the HIF-1 mRNA expression(±s，n=3)

4 讨论

PC12细胞(pheochromocyte cell)为大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞克隆化细胞株，具有神经细胞的特性，当细胞因缺氧受到损伤时，线粒体功能异常，氧化呼吸链受损，电子传递阻断，ATP产生减少。琥珀酸脱氢酶是呼吸链里的重要复合酶之一，测定其的活性可以反映PC12细胞缺氧损伤的程度。MTT比色法原理是活细胞内的琥珀酸脱氢酶可以将MTT(一种淡黄色的四甲基偶氮唑盐)还原成蓝紫色甲臜，此物质的光吸收值与细胞活性成正比关系［4］。乳酸脱氢酶存在于所有动物的组织中，缺氧导致PC12细胞膜损伤时，细胞内乳酸脱氢酶外漏，导致培养基中乳酸脱氢酶的活性升高，测定乳酸脱氢酶活性是检测细胞膜损伤程度的一个灵敏指标。结果表明:PC12细胞缺氧后核固缩，折光度减弱，最终细胞脱落。采用MTT法考察表明缺氧环境能够抑制细胞增殖，细胞缺氧损伤后细胞活力降低，48 h时增殖抑制极明显。缺氧2，4，8，12 h后细胞培养液中乳酸脱氢酶的活性明显增加，缺氧24 h后可能由于大量细胞凋亡和死亡的发生，乳酸脱氢酶活性明显降低。

Fig 5 The Dissocation plot of GAPDH and HIF-1 mRNA

Fig 6 The Amplification plot of GAPDH and HIF-1 mRNA

严重或持续缺氧时，缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)可诱导细胞凋亡。HIF-1α为缺氧应答的全局性调控因子，在缺氧诱导的哺乳动物细胞中广泛表达，对缺氧具有特异感受性，参与体内许多缺氧反应性基因的转录调节［5］。pHVL蛋白是E3泛素连接酶的一个组分，pHVL蛋白也是HIF-1α蛋白降解的一个靶点，在常氧环境下，HIF-1α结合pHVL蛋白，使HIF-1α在常氧细胞中低表达［6］。在缺氧环境能够抑制HIF-1α和pHVL蛋白的结合，HIF-1α的表达水平较高［7］。本实验的结果也表明缺氧2，4，8，12 h后 HIF-1 mRNA 的表达水平与对照组相比明显增高，提供了缺氧时间与HIF-1 mRNA的表达水平的时效关系。

现有研究表明缺氧损伤主要影响细胞膜电位、介质的合成、ATP合成、细胞酸碱代谢、细胞内游离Ca2+浓度、溶酶体的释放等［8］。目前抗缺氧损伤的研究主要集中于机体的整体水平方面，具有良好抗缺氧作用的药物不断被学者们发现，如:茵陈素［9］、丹参酮-ⅡA磺酸钠［10］等，但细胞分子水平上的研究还不够深入，阐明缺氧的损伤机制和抗缺氧药物的作用靶点需从分子水平进行研究。本研究为进一步探讨缺氧的细胞和分子机制提供了一定的理论依据，相信随着缺氧损伤相关研究的进展，将有助于阐明缺氧的详明机制，最终将为研制出抗缺氧疗效好、毒副作用小的抗缺氧新药提供更多的机制依据。

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