双黄连注射液HPLC指纹图谱研究

王艳伟， 宋立言， 代雪平， 宋汉敏

(1.河南省食品药品检验所，河南郑州450003;2.郑州大学临床药理研究所，河南 郑州450052)

双黄连注射液是由金银花、黄芩、连翘制成的现代中药制剂，具有清热解毒、清宣风热的作用。临床上用于外感风热引起的发热、咳嗽、咽痛。适用于病毒及细菌感染的上呼吸道感染、肺炎、扁桃体炎、咽炎等［1］。但随着使用范围日渐扩大，应用人群增加，加之临床应用不当及生产工艺不稳定多方面因素，引起的不良反应例数也相应增加，甚至有致人死亡的个案［2-3］。为进一步规范双黄连注射液的生产，提高其质量，减少不良反应的发生，根据国家食品药品监督管理局《中药注射剂安全性再评价基本技术要求》，本实验建立了双黄连注射液的HPLC指纹图谱，为双黄连注射液的全面质量控制提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters Alliance 2695系统，含四元梯度泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱以及Waters Empower色谱工作站，Waters二极管阵列检测器(PDA 996);Phenomenex Luna C18(2)100A(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱。

1.2 试剂与样品 绿原酸对照品(批号110753-200413，中国药品生物制品检定所)，咖啡酸对照品(批号110885-200102，中国药品生物制品检定所)，黄芩苷对照品(批号110715-200514，中国药品生物制品检定所)，黄芩素对照品(批号111595-200604，中国药品生物制品检定所);甲醇、乙腈为色谱纯(Merck公司)，磷酸为分析纯(天津市风船化学试剂科技有限公司)，水为超纯水;黄芩、金银花、连翘药材由河南福森药业有限公司提供，并经河南省食品药品检验所雷留成副主任药师鉴定;注射用黄芩提取物、注射用金银花连翘提取物由河南福森药业有限公司提供;双黄连注射液由河南福森药业有限公司提供(批号:0910001，0910002，0910003，0910004，0910005，0910006，0910009，0910010，0910011，0910012，0910016，0910018，0910019，0910020)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 双黄连注射液:Phenomenex Luna C18(2)100A 色谱柱:(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相为乙腈(A)－0.5%磷酸溶液(B)进行梯度洗脱，0 ～5 min，5%A ～5%A，5 ～15 min，5%A ～10%A，15 ～20 min，10%A ～14%A，20 ～50 min，14%A～18%A，50 ～70 min，18%A ～25%A，70 ～85 min，25%A ～30%A，85 ～110 min，30%A ～50%A，体积流量1 mL/min;检测波长350 nm;柱温40℃。理论板数按绿原酸峰计算应不低于6000。

黄芩药材、注射用黄芩提取物、金银花药材、注射用金银花连翘提取物色谱条件同上，连翘药材检测波长为280 nm，其余条件同上。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取绿原酸对照品适量，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成每1 mL含60 μg的溶液，即得(10℃以下保存)。

2.3 供试品溶液的制备

2.3.1 黄芩 取本品粉末约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，加热回流2 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.2 注射用黄芩提取物 取本品约50 mg，精密称定，置25 mL量瓶中，加水20 mL，超声处理10 min，振摇并滴加0.1 mol/L氢氧化钠溶液使完全溶解(pH值不大于7.0)，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.3 金银花 取本品粉末约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，加热回流2 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.4 连翘 取本品粉末约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水50 mL，称定质量，加热回流4 h，放冷，再称定质量，用水补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.5 注射用金银花连翘提取物 精密吸取本品2 mL，置100 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3.6 双黄连注射液 取本品，摇匀，滤过，作为供试品溶液。

2.4 样品测定 精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录110 min色谱图。将色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，与对照指纹图谱相比较，计算相似度。

3 方法学考察

3.1 精密度试验 取同一批次供试品溶液(批号:0910001)，连续进样6次，测定指纹图谱。结果表明，各色谱峰相对保留时间的RSD均在0.2%以内，相对峰面积的RSD均在5%以内，有较高的相似度(均在0.95以上)，精密度良好。

3.2 稳定性试验 取同一批次供试品溶液(批号:0910001)，分别在第 0、2、4、6、8、10 h 进样，测定指纹图谱。结果表明，各色谱峰相对保留时间的RSD均在0.2%以内，相对峰面积的RSD均在5%以内，有较高的相似度(均在0.95以上)，供试品溶液在10 h内基本稳定。

3.3 重复性试验 取同一批次样品(批号:0910001)，平行制备6份供试品溶液，测定指纹图谱。结果表明，各色谱峰相对保留时间的RSD均在0.2%以内，相对峰面积的RSD均在5%以内，有较高的相似度(均在0.95以上)，重复性良好。

4 双黄连注射液指纹图谱的建立

测定本品14批样品的指纹图谱，将其结果导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004，1.0A版)，以平均数法生成对照图谱，评价各样品的相似度，结果见图1、表1(屏蔽12号黄芩苷峰)。确定特征峰14个，统计了各批总出峰数，特征峰数与总出峰数的百分比及特征峰与总出峰面积的百分比。见表2。

5 双黄连注射液对照指纹图谱中色谱峰的确认

取大黄酚、大黄素甲醚、咖啡酸、绿原酸、连翘苷、黄芩苷、芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、木犀草苷、木犀草素、槲皮素、黄芩素、汉黄芩素、汉黄芩苷、隐绿原酸、新绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、连翘酯苷A等对照品，分别配制成适当质量浓度的对照品，按照指纹图谱测定方法，测定对照品色谱图，并与对照指纹图谱中的相关峰进行光谱图比对，最后确认对照指纹图谱中1号峰为新绿原酸，2号峰为绿原酸，3号峰为隐绿原酸，4号峰为咖啡酸，7号峰为连翘酯苷A，9号峰为异绿原酸B，10号峰为异绿原酸A，11号峰为异绿原酸C，12号峰为黄芩苷，14 号峰为黄芩素［4］。

表1 14批双黄连注射液指纹图谱相似度结果Tab.1 The results of the 14 batches of Shuanghuanglian Injection Similarity analysis

图1 双黄连注射液对照指纹图谱Fig.1 The HPLC fingerprint of Shuanghuanglian Injection

表2 14批双黄连注射液的总出峰数及其特征峰所占比例Tab.2 The total numbers of the peaks of Shuanghuanglian Injection and its proportion of the characteristic peaks

6 双黄连注射液对照指纹图谱中特征峰的归属

取黄芩、黄芩提取物、金银花、连翘、金银花连翘提取物制成适当浓度的供试品溶液，按照指纹图谱测定方法，测定各自色谱图，并与对照指纹图谱中的相关峰进行光谱图比对，最后确认对照指纹图谱中1号峰为新绿原酸，2号峰为绿原酸，3号峰为隐绿原酸，9号峰为异绿原酸B、10号峰为异绿原酸A、11号峰为异绿原酸C，上述峰均来自金银花;4号峰为咖啡酸，来自金银花和连翘;7号峰为连翘酯苷A，与5、6号峰均来自连翘;12号峰为黄芩苷，14号峰为黄芩素，与8号、13号峰均来自黄芩［5］(图2～图6)。

图2 注射用金银花连翘提取物指纹图谱Fig.2 The HPLC fingerprint of extract of Loniceral japonicae Flos and Forsythiae Fructus

7 讨论

7.1 洗脱系统的选择 试验过程中共选择了甲醇－0.5% 冰醋酸溶液［6］、乙腈 － 0.5% 冰醋酸溶液［7］、乙腈 －0.5%磷酸溶液等3种流动相系统，结果表明乙腈－0.5%磷酸溶液分离效果最好。

图3 连翘指纹图谱Fig.3 The HPLC fingerprint of Forsythiae Fructus

图4 金银花指纹图谱Fig.4 The HPLC fingerprint of Lonicerae japonicae Flos

图5 黄芩指纹图谱Fig.5 The HPLC fingerprint of Scutellariae Radix

图6 注射用黄芩提取物指纹图谱Fig.6 The HPLC fingerprint of Scutellariae Radix extract

7.2 检测波长的选择 试验过程中，波长为254 nm和280 nm下，黄芩苷峰过大，其他峰相对峰面积不稳定，不易分开，波长350 nm下各峰比例良好，峰与峰间距良好，易于分辨，故选择350 nm为测定波长。

7.3 柱温的选择 为了保持色谱分析的一致性，设定柱温来控制不同实验环境下的色谱分析，试验中考察了25℃、30℃、35℃、40℃柱温下的分离情况，结果表明，柱温40℃时分离效果较好。

7.4 实验中发现双黄连注射液指纹图谱与注射用金银花连翘提取物指纹图谱存在一定差异，原因可能是双黄连注射液制备工艺中用40%氢氧化钠溶液调pH值，在加热灭菌及放置过程中使绿原酸同系物及连翘酯苷同系物发生了水解反应所致，具体反应机理尚需进一步研究。

7.5 实验中确定了14个特征色谱峰，较为全面的反映了双黄连注射液药理作用的物质基础，为加强双黄连注射液质量控制提供了依据。但双黄连注射液有效成分复杂［8-12］，尚需进一步研究其药理、毒理的物质基础和作用机理，确定双黄连注射液临床疗效和不良反应产生的根源，为临床合理用药提供科学依据。

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